駱駝源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法編制說明

編制說明項(xiàng)目名稱： 駱駝源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法項(xiàng)目編號(hào)： 內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號(hào)編制單位： 錫林郭勒職業(yè)學(xué)院一、工作簡(jiǎn)況本項(xiàng)目來源于2018年第3批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目（內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號(hào)）。起草單位為錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，協(xié)作單位為錫林郭勒食品檢驗(yàn)檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心。主要起草人：郭梁、徐偉良、馮偉、郭元晟、李春冬、劉國強(qiáng)。二、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義來源于駱駝的肉乳制品在內(nèi)蒙古自治區(qū)深受消費(fèi)者的喜愛， 也是特種乳制品市場(chǎng)重要組成部分。由于市場(chǎng)中存在用低價(jià)肉乳制品冒充高價(jià)肉乳制品的欺詐違法行為，亟需制定針對(duì)肉乳制品的駱駝源性成分檢測(cè)方法。目前，已經(jīng)存在兩項(xiàng)駱駝源性檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物源性飼料中駱駝源性成分定性檢測(cè)方法PCR方法（GB/T21100-2007）；出口食品中駱駝源性成分的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法（SN/T4418-2016）。在采用上述檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)：目前缺乏基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對(duì)肉乳制品的駱駝源性成分檢測(cè)方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)是基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對(duì)肉乳制品的駱駝源性成分檢測(cè)方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，具有快速、高通量以及去除假陰性等特征。三、主要起草過程本標(biāo)準(zhǔn)制定工作從2018年10月開始，組織成立了標(biāo)準(zhǔn)起草團(tuán)隊(duì)。起草團(tuán)隊(duì)首先進(jìn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、專利以及論文的收集和整理工作，制定了基于多重實(shí)時(shí)熒光 PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對(duì)肉乳制品的動(dòng)物源性成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系的研發(fā)目標(biāo)，計(jì)劃形成駱駝Camelusbactrianus）、馬（Equuscaballus）、黃牛（Bostaurus）、水牛（Bubalusbubalis）、牦牛（Bosgrunniens）、山羊（Caprahircus）、綿羊（Ovisaries）、豬（Susscrofa）、驢（Equusasinus）、梅花鹿（Cervusnippon）、雞（Gallusgallus）、鴨（Anasplatyrhynchos）及鵝（Anseranser）等13個(gè)物種、針對(duì)肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）的常見動(dòng)物源性成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：（一） 在NCBI中下載不同物種（駱駝、馬、牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、豬、驢、梅花鹿、雞、鴨及鵝等 13個(gè)物種）的線粒體序列。為了保證引物和探針的物種適用性，每個(gè)物種下載5-20個(gè)品種或品系的線粒體序列；利用生物信息學(xué)軟件（ClustalX或MAGE5）對(duì)所下載的線粒體序列進(jìn)行比對(duì)。篩選物種間特異品種間保守的序列為目標(biāo)靶向區(qū)域（5-10個(gè)），針對(duì)目標(biāo)靶向區(qū)域設(shè)計(jì)5組引物和探針組合。上游引物的3’端距離探針的5’端為1-20bp，探針的5’端避免出現(xiàn)G，探針Tm要高于引物Tm值10℃左右；不同物種的探針用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記（FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探針Tm值和引物Tm值接近，探針3’端可以選擇MGB基團(tuán)；（二） 收集各種來源于不同動(dòng)物的肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）。利用改良CTAB法提取樣品的DNA（A260nm/A280nm≈1，.8瓊脂糖凝膠電泳主帶無拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性較高）；（三） 特異性分析：利用實(shí)時(shí)熒光 PCR對(duì)5組引物和探針進(jìn)行檢測(cè)，有典型擴(kuò)增曲線且 Ct值≤35計(jì)為檢出。在陽性對(duì)照檢出、陰性對(duì)照未檢出、對(duì) 5組引物和探針進(jìn)行特異性的分析評(píng)價(jià)。反應(yīng)體系（20μL）：TransStartProbeqPCRSuperMix10 （μL北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物各1μL，探針各0.5μL，模板DNA1μL，補(bǔ)水至20μL。反應(yīng)條件：94℃、30s，1個(gè)循環(huán)；94℃、5s，60℃、31s，40個(gè)循環(huán)；（四） 絕對(duì)靈敏度分析：以來源于不同肉乳制品的高質(zhì)量 DNA為模板母液，用滅菌 ddH2O稀釋模板母液，共稀釋 10個(gè)梯度，稀釋后質(zhì)量濃度分別為 100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001ng/。μL以不同稀釋濃度的DNA為模板對(duì)5組引物和探針進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對(duì)于不同濃度模板DNA的檢測(cè)靈敏度。檢出限（LOD）統(tǒng)計(jì)分析參照Probitanalysis。比較5組引物和探針的絕對(duì)靈敏度，分析引物和探針的特異性和保守性與絕對(duì)靈敏度之間的相關(guān)性；（五） 摻假檢出限（相對(duì)靈敏度）分析：首先，制備模擬摻假混合樣品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述摻假組為模板對(duì) 5組引物和探針進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù) PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對(duì)于不同濃度摻假的摻假檢出限。檢出限LOD）統(tǒng)計(jì)分析參照Probitanalysis。比較5組引物和探針的摻假檢出限（相對(duì)靈敏度），分析引物和探針的特異性和保守性與摻假檢出限之間的相關(guān)性；（六） 定量分析：以模板質(zhì)量濃度和摻假濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和摻假定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析引物和探針的特異性和保守性與擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)的相關(guān)性；利用已知濃度的盲樣驗(yàn)證定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的適用性，通過擴(kuò)增效率（90%-110%）、相關(guān)系數(shù)R2（≥0.99）以及回收率（90%-110%）評(píng)價(jià)5組引物和探針的定量分析能力，分析引物和探針的特異性和保守性與定量分析能力之間的關(guān)系；（七）相關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)進(jìn)行論文投稿以及專利申請(qǐng)。目前發(fā)表SCI論文2篇，在投稿SCI論文3篇，中文核心論文8篇，申請(qǐng)國家發(fā)明專利8項(xiàng)（授權(quán)1項(xiàng)）。最終通過上述實(shí)驗(yàn)確定駱駝源性成分檢測(cè)的引物和探針以及絕對(duì)靈敏度（1pg）和相對(duì)靈敏度（0.1-1%）。此方法具有駱駝源性的特異性，來源于駱駝的肉乳樣品均出現(xiàn)相應(yīng)探針的典