實驗植物基因組的提取

關(guān)于實驗植物基因組的提取第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三第一部分植物基因組DNA的提取第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)并掌握植物基因組DNA的提取原理和方法；2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的原理和操作；3、學(xué)習(xí)并掌握對電泳檢測基因組DNA結(jié)果的初步分析。第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三二、實驗基本原理植物基因組DNA的提取一般經(jīng)過破碎細(xì)胞壁、裂解細(xì)胞膜、除去多糖和酚等次生物質(zhì)、變性蛋白質(zhì)、沉淀核酸、去除RNA和濃縮DNA等幾個步驟。傳統(tǒng)提取方法主要有二種：十六烷基三乙基溴化銨（CTAB)法、十二烷基硫酸鈉(SDS)法。其基本原理是：十六烷基三甲基溴化銨和十二烷基硫酸鈉等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，加入RNA酶去除核酸中的RNA,即得植物基因組DNA溶液。

由于植物中的次生代謝產(chǎn)物——多酚類化合物可介導(dǎo)DNA降解，而多糖的污染也是影響植物核酸純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等分子生物學(xué)酶類的生物活性。傳統(tǒng)的CTAB-DNA提取法步驟多，較煩瑣，DNA產(chǎn)率低，而且由于酚很難完全去除，容易影響以后的酶切等工作的效率。SDS法操作簡單，溫和,也可提取到較高分子量DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多,這將直接影響DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果。由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。

第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三

本實驗采用十二烷基硫酸鈉(SDS)法提取植物基因組DNA，基因組DNA提取后，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA分子量大小、純度；用紫外吸收法測定基因組DNA純度與含量。DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定:

DNA分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的溶液中帶負(fù)電荷，它在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即具有不同的相對分子量的DNA片段泳動速度不同。DNA片斷在凝膠中當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色后，在紫外光下可見橙紅色帶，并可確定DNA片斷在凝膠中的位置。第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三影響DNA泳動速率（遷移率）的因素有：⑴DNA分子質(zhì)量的影響：雙鏈DNA分子遷移的速率與DNA分子量對數(shù)成反比。分子量越大，遷移率越小。⑵DNA構(gòu)型的影響：超螺旋DNA＞線狀DNA＞開環(huán)DNA⑶膠濃度的影響：濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度為1％～2％；⑷電場強度的影響：電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，（一般5V/cm）（電場強度）。而對于大片段電泳，甚至用0.5～1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。⑸EB的影響：溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。⑹電泳緩沖液的影響:核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。TAE價格低廉，但緩沖能力低，必須進行兩極緩沖液的循環(huán)。

TPE在進行DNA回收時，會使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用

TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價離子，抑制DNase，保護

DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負(fù)電，向正極移動。⑺堿基組成與電泳溫度的影響:

一般影響不大第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三在DNA提取過程中必須始終注意以下幾個關(guān)鍵問題：（1）DNA的二級結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素（如強酸、強堿、加熱、低鹽濃度、有機溶劑、酰胺類、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時避免使用變性的條件。（2）抑制內(nèi)外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜絕，現(xiàn)可以通過多種途徑來做到這一點：a、低溫操作；b、調(diào)節(jié)pH，使偏堿（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（EDTA）除去酶的鋪助因子（Mg2+），使酶活性喪失。（3）防止化學(xué)降解。如過酸或過堿以及其它化學(xué)因素，會使DNA降解，一般綜合考慮，取pH8.0左右為宜。（4）防止物理因素降解。如溫度太高或機械張力剪切等，DNA分子特別大，極易被機械張力拉斷，甚至在細(xì)管中稍急一些的流動也會使DNA斷裂，所以在抽提過程中要特別注意這一點，操作過程要盡量簡便、溫和、減少攪拌次數(shù)，也不要劇烈搖動。（5）植物的次生代謝物（主要是胞質(zhì)內(nèi)的多酚類或色素類化合物）對核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，這是因幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鮮的。第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三三、實驗材料與試劑1、實驗材料：植物幼嫩葉子2、實驗試劑（1）基因組DNA提取緩沖液（2）氯仿:異戊醇:乙醇抽提液（3）TE緩沖液（4）平衡酚：（5）RNA酶A（6）酚/氯仿（7）氯仿/異戊醇（8）異丙醇、無水乙醇、70%乙醇。（9）3mol/LNaAc（10）5×TBE緩沖液（11）6×電泳上樣緩沖液（12）1.0%瓊脂糖凝膠（13）EB （14）DNA分子量Markers：

125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三四、實驗器材與儀器1、研體2、離心機、離心管（7ml）及離心管架；3、微量移液器10ul、1000ul及槍頭；4、恒溫水浴箱65℃5、制冰機；6、冰箱；7、恒溫水浴箱37℃；8、微波爐；9、電泳儀及電泳槽；10、紫外檢測儀。第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三五、實驗操作方法和步驟

置于預(yù)熱到65℃的研體中，加少許石英砂；加入預(yù)熱到65℃的核酸提取緩沖液3ml稱取植物幼嫩葉子0.5g迅速研成勻漿轉(zhuǎn)移到7ml帶蓋離心管中65℃水浴保溫1hr，其間經(jīng)常輕柔搖動加入3ml氯仿-異戊醇-乙醇溶液輕柔顛倒混勻后，室溫靜置分層5min離心5,000g×5min上清液轉(zhuǎn)移到干凈7ml離心管中，記錄體積，棄沉淀，*①加入等體積異丙醇試劑，混和后靜置20min沉淀DNA4℃離心5,000g×3min收集絮狀沉淀加入3mlTE，65℃水浴中助溶15min，使之完全溶解加入等體積的平衡酚，輕柔顛倒混勻，室靜置10min4℃離心12,000g×10min轉(zhuǎn)移上清于新7ml離心管中，記錄體積*②加入1/2體積的平衡酚與1/2體積的氯仿，輕柔顛倒混勻，室溫放置15min4℃離心（12,000g，5min）吸取上清轉(zhuǎn)移到一新7ml離心管中，記錄體積*③加入等體積的氯仿，顛倒混勻，室溫放置5min4℃離心（12,000g，10min）吸取上清轉(zhuǎn)移到一新7ml離心管中，記錄體積*④加入5μlRNase（5μg/μl），37℃

保溫10min加入1/10體積3mol/LNaAC和2×體積–20℃預(yù)冷的無水乙醇–20℃放置20min*⑤4℃離心（5,000g，3min）收集沉淀*⑥用70%乙醇洗滌沉淀，傾倒掉乙醇溶液，干燥，讓酒精完全揮發(fā)用1mlTE溶解沉淀，即為植物基因組DNA溶液*⑦凝膠電泳檢測基因組DNA（分子量大小、純度）4℃保存?zhèn)溆谜f明：如果蛋白質(zhì)和RNA未去除干凈，重復(fù)酚，酚/氯仿，氯仿抽提步驟，繼續(xù)用RNase處理，乙醇沉淀和洗滌，重溶于TE中，直至基因組DNA純度和質(zhì)量符合要求。（一）植物基因組DNA的提取①②紫外吸收法測定基因組DNA純度與含量第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三①②③④*植物基因組DNA的提取操作過程現(xiàn)象第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三⑤⑥⑦*植物基因組DNA的提取操作過程現(xiàn)象第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三1、制膠（1％瓊脂糖凝膠）在膠模上架好梳子。稱取01g瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加100ml0.5×TBE電泳緩沖液，加熱熔化至無顆粒狀瓊脂糖，待其冷卻至50～60℃后，加入EB，使其終濃度為0.5mg/L，搖勻后立即倒入準(zhǔn)備好的膠模中，待膠凝固后，放入電泳槽中，倒入適量0.5×TBE（剛好淹過膠面），拔去梳子備用。（注：EB為誘變劑、致癌物，接觸凝膠必須戴手套操作）2、加樣取5ul純化的DNA原溶液樣品，與1ul6×電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中（注：勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡）。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要換槍頭以防互相污染。注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。3、電泳加完樣后，蓋上電泳槽蓋，立即接通電源，使電壓調(diào)到100V，恒壓電泳。當(dāng)溴酚藍條帶移動到距凝膠前緣約2cm時，停止電泳（約需30～60min）。4、觀察和拍照取出膠塊置于紫外燈下觀察，DNA存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶，再用成像儀進行拍照，以便于分析。（注：紫外光對眼睛有害，觀察時戴上防護鏡或眼鏡，或隔著玻璃或有機玻璃觀察）。（二）瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三第二部分基因組DNA純度與含量的測定第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)紫外吸收法測定核酸基本原理和方法；2、學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收法測定基因組DNA純度與含量的方法。第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三二、實驗基本原理核酸——DNA和RNA所含堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)（嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)）的共軛雙鍵具有紫外吸收的性質(zhì)，它們在260nm處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長進行核酸含量的測定。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度的大小不僅與總含量有關(guān)，也與它們的不同構(gòu)型而有差異。對標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1μg/ml時，DNA鈉鹽的OD260＝0.02。

當(dāng)OD260＝1時，雙鏈DNA含量約為50μg/ml

單鏈DNA含量約為37μg/ml

RNA含量約為40μg/ml

寡核苷酸含量約為30μg/ml（由于底物不同有差異）1、核酸樣品DNA、RNA含量的測定：如用1cm光徑石英比色皿，用H2O稀釋DNA或RNA樣品n倍并以H2O為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前DNA的含量：

DNA（μg/μl）=50×OD260讀數(shù)×DNA樣品稀釋倍數(shù)/1000RNA（μg/μl）=40×OD260讀數(shù)×RNA樣品稀釋倍數(shù)/1000

若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進行定量，可使用溴化乙錠法或其他方法進行估算。第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三

當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測定。由于DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。所以，一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計算它們的比值來判斷核酸樣品的純度。2、核酸樣品純度判斷的一般標(biāo)準(zhǔn)：⑴DNA純度：OD260/OD280≈1.8，表示為純的DNA；

OD260/OD280＞1.9，表示有RNA污染；

OD260/OD280＜1.6，表示有蛋白質(zhì)、酚等污染。⑵RNA純度：1.7＜OD260/OD280＜2.0，表示為純的RNA；

OD260/OD280＜1.7時，表示有蛋白質(zhì)或酚污染；

OD260/OD280＞2.0時，表示可能有異硫氰酸殘存。⑶OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進行定量；同時也會影響酶切和PCR的效果。第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三三、實驗材料與試劑1、實驗材料

植物基因組DNA樣品2、實驗試劑⑴ddH2O；⑵TE緩沖液（pH8.0）。四、實驗器材與儀器1、離心機、離心管（5ml）及離心管架；2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及槍頭；3、紫外分光光度計；4、石英比色皿（0.5cm光徑）或1cm光徑的微量石英比色皿（50ul、100ul）。第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三五、實驗操作方法和步驟方法1：將提取的植物基因組DNA樣品吸取20ul，加到新的5ml離心管中，再加一定量的ddH2O或TE緩沖液（pH8.0）稀釋100倍，用0.5cm光徑石英比色皿（約需1.6ml樣品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度計上測定230nm、260nm、280nm處的吸光度。計算植物基因組DNA樣品溶液的DNA的含量以及DNA樣品的純度。

方法2：直接取植物基因組DNA樣品微量原液（1～2ul)，用分光光度計進行自動測定出230nm