Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA

實驗

0Y果蠅遺傳標記分析-PAPD一、實驗目的：

1.掌握RAPD分析基本方法技術; 2.了解分子標記的重要應用價值.二、主要內(nèi)容：

基因DNA提取 PCR反應 電泳 電泳圖譜的觀察、分析助教：王家文Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!（1）D.Virilis------------10只（2）黑腹果蠅—P、F1、F2（3）其他材料--0.2g1份（3種果蠅樣品+2種其他）/小組果蠅用自己存的材料。材料：Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!

1.提取粗DNA液現(xiàn)在先做（合理分工、協(xié)調(diào)時間）：每份材料（普通果蠅20只、大果蠅10只、或其他材料0.2g）+50μL勻漿緩沖液勻漿液體倒入1.5ml離心管+等V苯酚-氯仿（1:1）顛倒混勻30s,12000rpm，5分鐘。助教把握時間?。?50μL10%SDS顛倒混勻20s，65度水浴30min加入200μL的勻漿液10000rpm，3min，轉(zhuǎn)移上清。Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!移上清于另一離心管，+等V苯酚-氯仿（1:1）顛倒混勻，13000rpm，5分鐘。12000rpm，10min移上清于另一離心管，加入2倍體積的無水乙醇，靜置10min。棄上清，70%乙醇洗滌沉淀，10000rpm，3min棄上清，超凈臺吹干沉淀。加入20ul的無菌水，溶解沉淀，備用。注意：轉(zhuǎn)移上清時記住上清的準確體積，另外轉(zhuǎn)移時操作要小心，槍頭從液面上層往下層緩慢的移動，不要帶入其它雜質(zhì)。Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!三、實驗原理:

RAPD:建立在PCR基礎上的一種分子標記。 模板高溫變性→足夠低的溫度下（通常為36℃）與隨機引物（一般10個bp）退火→PCR→電泳 如果兩個退火位點足夠近（200-2000bp左右）、分別位于互補的DNA鏈上，可以通過PCR擴增出DNA片段。

引物結合位點DNA序列的改變以及兩擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導致擴增片段數(shù)目和長度的差異，經(jīng)電泳分離后通過EB染色以檢測DNA片段的多態(tài)性。Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!3.RAPD反應1‘．在0.2mlPCR管中配制20μl反應體系

隨機引物1μL

ddH2O6μL每組領取5份樣品所需量各組等分5份

分別加5種樣品的模板DNA各3μL包括dNTPMixture,Taq酶,10×PCRbufferPCRmixture10μL

Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁! 操作分工 技術問題 注意事項實驗課老師助教指導：注意聽實驗報告（為果蠅系列實驗的最后部分）：

1.簡單體現(xiàn)RAPD的實驗原理、解決的問題； 2.實驗結果（照片）顯示出來（信號弱的可用畫模式圖輔助體現(xiàn)），標出樣品名稱、差異條帶等，進行分析。

Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!利用10個堿基的一個或幾個隨機引物非定點地擴增DNA片段，一般一個引物可擴增6-12條DNA片段，利用凝膠電泳分開擴增的片段，從而進行基因多態(tài)性研究。RAPD是一種能快速進行基因多態(tài)性研究的技術，并且由于不涉及印跡雜交、放射性自顯影等技術，因此簡便易行。RAPDY果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!RFLPY果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!“AFLP”續(xù)： 由于變異、進化，一種引物可以使某一品系的DNA片段復制（擴增），而不能使另一品系的DNA片段復制（擴增）。 電泳分離：同一引物擴增品系1品系2引物如：EcoRI和MseI相關引物Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!短串聯(lián)重復序列STRs(shorttendemrepeats,mini-satellites)STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是1bp-8bp的串聯(lián)重復，重復次數(shù)n=15-60，已知8000多個，主要形式為：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n為多見。1992年，Welssenbanch等以STR為標記的第二代連鎖圖取代了RFLP連鎖圖。Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!定義：不同個體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。1996年，Lander報道了用單核苷酸多態(tài)性標記（singlenucleotidpolymorphismSNP）制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標記。 可通過雜交、序列分析、電泳等檢測。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!1,Neutralalteration:abasesubstitutionwithnoeffectontheaminoacidresidueencoded.2,Conservativechange:abasesubstitutionthatresultsinanalteredaminoacid,buthasminimaleffectonproteinstructureorfunction.3,Non-conservativealteration:leadingtoachangeintheencodedaminoacidresiduethathasdramaticeffectsonproteinstructureorfunction.TheFunctionalEffectsofcSNPsY果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!（1）組織勻漿液（已經(jīng)準備好）

： LiCl0.40mol·L-1

Tris·HCl0.20mol·L-1（pH9.0） EDTA2.5mmol·L-1 RNaseA100g·L-1（2）

SDS10%<wt/vol>（已經(jīng)準備好）相關試劑(3)25xTAE(在15’離心時配制)500ml用于后邊的電泳

Tris12.1g冰醋酸2.86mLNa2EDTA?2H2O1.86gddH2O定容到100mL(一人配置，全班公用，用時稀釋)Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!若位點2處堿基發(fā)生改變，則Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!2’．在PCR熱循環(huán)儀中進行如下反應：

94℃200s→94℃60s→36℃60s→72℃120s

40個循環(huán)

→72℃(300s--600s)4．電泳（后繼課中*） 1.5%瓊脂糖凝膠（用20mL的1×TAE溶解瓊脂糖配制）電泳，觀察比較不同品系或同一品系親子代間的條帶的不同，并照相記錄。*第12周“非中斷雜交實驗”的“擴菌、倒所有的平板”步驟后（可以由一個同學提前一會兒進行）Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!補充知識（課后閱讀）：RAPDRFLPAFLPSTRSNPY果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!是英文RestrictionFregrmeatLengthPo1ymor—Phism的縮寫，意思是“限制性片段長度多態(tài)性”。RFLP是根據(jù)不同品種（個體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變，或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。RFLPY果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!RFLPY果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!AFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphism.AFLPtechnologybinesthepowerofRestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)withtheflexibilityandpowerofPCR.Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!熒光標記全自動AFLP原理與方法Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!可變數(shù)目串聯(lián)重復序列VNTRs(variablenumbertandemrepeats)每個VNTR都含有10-15bp核心序列，VNTR與STR比較類似，但是重復順序更長；多態(tài)性及分布方面不如STR，因而VNTR作為遺傳標記只是一種過渡，目前已較少使用，但是，VNTR曾經(jīng)對STR的基因定位運用起到推動作用。Y果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!1，ThemostabundantDNAmarkerpresentinthehumangenome，about90%ofsequencesvariantsinhumanareSNP.ThereisoneSNPinevery1000basesleadstoanestimatethatanytwoindividualsdifferbyuptothreemillionSNPs.2，Afewhundredthousandarecurrentlyidentified,but17millionofSNPsoutof3billionareestimated.3,SNPsincodingregionsofgeneshavebeentermedcSNPs,about500,000ofcSNPsandanaverageofabout6pergene.

FrequencyofSNPinHumanGenomeY果蠅與其他物種遺傳標記比較分析RA共27頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!Majorchangesinproteinstructurecan