干細(xì)胞和干細(xì)胞治療ppt

關(guān)于干細(xì)胞和干細(xì)胞治療ppt1第1頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三2干細(xì)胞

stemcell未分化細(xì)胞自我更新

(self-renew)無限增殖體外長期培養(yǎng)多向分化潛能

(multipotential)第2頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三3第3頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三4干細(xì)胞的類型：

胚胎干細(xì)胞embryonicstemcells

胚胎干細(xì)胞主要是指來自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，有自我更新和多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的各類細(xì)胞。成體干細(xì)胞

adultstemcells

成體干細(xì)胞是處于干細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞，包括成年和未成年動(dòng)物組織中的各種干細(xì)胞，因此又稱為組織干細(xì)胞。如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞等。第4頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三5胚胎干細(xì)胞embryonicstemcells（ES細(xì)胞）第5頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三6胚胎早期發(fā)生：囊胚形成

（囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）第6頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三7排卵、早期胚胎發(fā)生

(囊胚形成)第7頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三8胚胎干細(xì)胞的分離和建系

將囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞通過體外培養(yǎng)產(chǎn)生未分化的細(xì)胞克隆，建立胚胎干細(xì)胞系1981年Evans和Martin首次成功分離和建立小鼠胚胎干細(xì)胞系1998年Thomson等首次成功分離和建立人胚胎干細(xì)胞系胚胎干細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化形成各種成體細(xì)胞第8頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三9胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化外源誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化

誘導(dǎo)因子：維甲酸(RA)、骨形成蛋白BMPs)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)等轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化

用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使某種促分化基因在ES細(xì)胞中表達(dá)、調(diào)節(jié)其分化與其他細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化

創(chuàng)造細(xì)胞分化的微環(huán)境第9頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三10胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化第10頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三11成體干細(xì)胞adultstemcells又稱組織干細(xì)胞tissuestemcells第11頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三12成體干細(xì)胞的概念成體干細(xì)胞又稱組織干細(xì)胞，傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為它們是存在于成體組織的未分化細(xì)胞，現(xiàn)在認(rèn)為也包括未成年動(dòng)物的組織干細(xì)胞，它們具有不斷增殖和自我更新能力、又具有多向分化潛能。

如造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、肝干細(xì)胞等第12頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三13成體干細(xì)胞的功能自然條件下成體干細(xì)胞傾向于分化成所在組織的細(xì)胞，參與組織更新和損傷修復(fù)；外界條件誘導(dǎo)下成體干細(xì)胞可橫向分化成其他組織的細(xì)胞，參與這些組織的損傷修復(fù)。第13頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三14造血干細(xì)胞的分化第14頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三15表皮干細(xì)胞的分化第15頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三16

干細(xì)胞應(yīng)用前景細(xì)胞治療組織工程藥物篩選發(fā)育研究基因功能研究第16頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三17

細(xì)胞治療

celltherapy

細(xì)胞治療是指將正?；蜻z傳改造過的人體細(xì)胞直接移植或輸入患者體內(nèi)，以達(dá)到替代受損細(xì)胞、治療疾病的目的。利用干細(xì)胞及其分化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療是干細(xì)胞臨床應(yīng)用的重要研究方向。

胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞都能用于細(xì)胞治療，但目前只有少數(shù)成體干細(xì)胞在細(xì)胞治療上己開始取得臨床療效，大多數(shù)的干細(xì)胞治療還在實(shí)驗(yàn)階段。第17頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三18血液病的細(xì)胞治療如白血病的細(xì)胞治療

造血干細(xì)胞移植：自體移植（臍帶血造血干細(xì)胞）無排斥反應(yīng)同系移植（同卵孿生之間骨髓造血干細(xì)胞）一般無排斥反應(yīng)同種移植（人與人之間骨髓造血干細(xì)胞）有排斥反應(yīng)（供、受者組織相容性抗原不同）

需組織配型、選擇供者（骨髓庫）；抑制受者的免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)免疫耐受。

第18頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三19神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療如帕金森氏病細(xì)胞治療胚胎干細(xì)胞細(xì)胞移植神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞移植

1、干細(xì)胞直接移植

2、誘導(dǎo)分化成相應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞（多巴胺能神經(jīng)元）后進(jìn)行細(xì)胞移植

第19頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三20心肌疾病的細(xì)胞治療如心肌梗塞的細(xì)胞治療

胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞細(xì)胞移植成體干細(xì)胞（骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞等）誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞細(xì)胞移植第20頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三21干細(xì)胞治療中的難點(diǎn)異體移植的免疫排斥反應(yīng)解決途徑：自身體細(xì)胞核移植（治療性克?。└杉?xì)胞基因改造采用自身干細(xì)胞成瘤性的危險(xiǎn)胚胎干細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)形成畸胎瘤，如何防止干細(xì)胞移植后可能因分化不徹底形成腫瘤，是必須解決的問題。解決途徑：完善定向誘導(dǎo)分化方法改進(jìn)篩選純化技術(shù)第21頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三22治療性克隆

（體細(xì)胞核移植）

第22頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三23我們實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)工作胰腺干細(xì)胞的β細(xì)胞分化與I型糖尿病的干細(xì)胞治療第23頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三24

I型糖尿病的治療外源胰島素治療胰腺或胰島移植干細(xì)胞治療：

胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成β細(xì)胞細(xì)胞移植基因?qū)胧蛊浔磉_(dá)胰島素細(xì)胞移植胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成β細(xì)胞細(xì)胞移植第24頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三25胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志

1990年，Lendahl等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞中存在一種新的中間絲蛋白—巢蛋白（nestin），現(xiàn)在nestin已是公認(rèn)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志之一。

2000年，Hunziker和Stein發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管和胰島中也存在nestin陽性細(xì)胞。

2001年，Zulewski等人從胰腺中分離到nestin陽性細(xì)胞，將其命名為NIPs（nestin-positiveislet-derivedprogenitorcells），并發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能(multipotential)，在體外可自發(fā)形成類胰島細(xì)胞團(tuán)（islet-likecellclusters,ICCs）.

因此，人們相信nestin可能也是胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志。但是，NIPs是否確實(shí)是胰腺干細(xì)胞，能否用于細(xì)胞治療必須進(jìn)一步證實(shí)。2001年起，我們?yōu)榇俗隽艘稽c(diǎn)實(shí)驗(yàn)。

第25頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三26我們的實(shí)驗(yàn):人胎胰腺

nestin陽性細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性檢測(cè)（目的是確認(rèn)NIPs是胰腺干細(xì)胞）；體外誘導(dǎo)分化NIPs形成能產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞；類胰島細(xì)胞團(tuán)(ICCs)異種體內(nèi)移植—糖尿病的干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)研究。第26頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三27

第一個(gè)實(shí)驗(yàn)：人胎胰腺nestin陽性細(xì)胞(NIPs)的分離、體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性檢測(cè)第27頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三28人胎胰腺的nestin陽性細(xì)胞的分布

免疫組化技術(shù)顯示nestin陽性細(xì)胞

nestin陽性細(xì)胞位于胰腺小導(dǎo)管壁及其相連的原始細(xì)胞團(tuán)第28頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三分離胎胰導(dǎo)管和細(xì)胞團(tuán)

在EHAA培養(yǎng)液（含2%FBS）中進(jìn)行原代培養(yǎng)

在EHAA培養(yǎng)液中的胎胰導(dǎo)管和細(xì)胞團(tuán)

培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞貼壁并開始鋪開第29頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三CK19

insulinnestin貼壁細(xì)胞鑒別：是否存在NIPs

免疫熒光染色檢測(cè)CK19、胰島素、nestin陽性細(xì)胞

呈CK19陽性的胰腺上皮細(xì)胞（細(xì)胞較大)

呈胰島素陽性的

β細(xì)胞（細(xì)胞較?。﹏estin陽性細(xì)胞(NIPs)（梭形）第30頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三31

NIPs的篩選培養(yǎng)和體外擴(kuò)增

貼壁細(xì)胞在無糖低血清條件培養(yǎng)液中篩選培養(yǎng)NIPs

4周后大部分細(xì)胞死亡、僅存少量梭形細(xì)胞(NIPs)

DMEM/F12培養(yǎng)液中加生長因子bFGF促進(jìn)梭形細(xì)胞(NIPs)體外擴(kuò)增。亞克隆純化、傳代培養(yǎng)圖為由單個(gè)梭形細(xì)胞(NIPs)的掃描電鏡照片梭形細(xì)胞(NIPs)可在體外長期傳代培養(yǎng)第31頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

NIPs的干細(xì)胞表型確定

免疫組化在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)nestin表達(dá)

半定量RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)nestin和干細(xì)胞標(biāo)志基因ABCG2表達(dá)

nestin

semiquantitativeRT-PCR篩選培養(yǎng)的梭形細(xì)胞(NIPs)集落免疫組化顯示篩選培養(yǎng)的細(xì)胞均呈nestin陽性反應(yīng)半定量RT-PCR顯示篩選培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)nestin和ABCG2第32頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三nestin

NIPs達(dá)到80%鋪滿時(shí)可自發(fā)形成小的ICCsNIPs能自發(fā)形成類胰島細(xì)胞團(tuán)(ICCs).NIPs在DMEM培養(yǎng)液(含11.1mM葡萄糖、10%FBS和20ng/mlbFGF)中培養(yǎng)免疫組化顯示這種ICCs主要由nestin陽性細(xì)胞組成RT-PCR顯示這種ICCs高水平表達(dá)ABCG2和nestin

RT-PCRanalysis第33頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

培養(yǎng)2周后形成的ICCs大而致密glucagon

NIPs具有多向分化潛能培養(yǎng)液中撤去bFGF使NIPs分化RT-PCRanalysis免疫組化顯示此時(shí)ICCs表達(dá)glucagonRT-PCR顯示此時(shí)ICCs有多種譜系基因的表達(dá)，具有向胰腺多種類型細(xì)胞分化的能力第34頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三35這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NIPs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志ABCG2，能長期培養(yǎng)，有多向分化潛能，在細(xì)胞形態(tài)、生長行為和分化潛能上具有干細(xì)胞特征，因此可以認(rèn)為是胰腺干細(xì)胞.

ABCG2是ABC運(yùn)輸?shù)鞍祝ˋTPbindingcassettetransporter）家族成員，其功能是將細(xì)胞內(nèi)的促分化因子泵出細(xì)胞以維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，現(xiàn)在認(rèn)為它是干細(xì)胞狀態(tài)決定因子。已有報(bào)道ES細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肌干細(xì)胞等均表達(dá)ABCG2。第35頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三36

第二個(gè)實(shí)驗(yàn)：

體外誘導(dǎo)分化NIPs形成產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞；第36頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

培養(yǎng)10天后形成很多大而致密的ICCsinsulin誘導(dǎo)NIPs形成β細(xì)胞

NIPs在含高濃度葡萄糖(16.5mM)和多種誘導(dǎo)因子(IGF,HGF,betacellulinandnicotinamide)的DMEM

培養(yǎng)液中培養(yǎng)

RT-PCRanalysis免疫組化顯示ICCs中有胰島素陽性的β

細(xì)胞此時(shí)ICCs表達(dá)β

細(xì)胞的標(biāo)志，但仍少量表達(dá)NIPs和其他細(xì)胞的標(biāo)志第37頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三38ICCs的細(xì)胞內(nèi)胰島素含量

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測(cè)定ICCs的細(xì)胞內(nèi)胰島素含量β細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的ICCs(ICC3)細(xì)胞內(nèi)胰島素含量明顯高于多向分化的ICCs(ICC2)，但仍低于胎胰胰島(islet)的胰島素含量第38頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

insulinsecretioninresponsetoglucose

葡萄糖或促分泌素對(duì)ICCs分泌胰島素的作用

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測(cè)定ICCs分泌胰島素量

T:tolbutamideC:carbacholG:GLP-1

insulinsecretioninresponsetosecretagogues在不同濃度葡萄糖刺激下ICCs中β細(xì)胞胰島素分泌量與萄葡糖濃度呈正相關(guān)各種分泌刺激因子刺激ICCs釋放胰島素。T--甲苯磺丁脲C--碳酰膽堿G--胰高血糖素樣肽第39頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三40

這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NIPs具有多向分化潛能，在一定條件下能定向分化為功能性β細(xì)胞.

第40頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三41

第三個(gè)實(shí)驗(yàn)：

類胰島細(xì)胞團(tuán)(ICCs)異種體內(nèi)移植—

糖尿病的干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)研究。

（將定向誘導(dǎo)人NIPs形成含β細(xì)胞的ICCs

移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺失小鼠體內(nèi)）第41頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三42糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射鏈脲佐菌素STZ)

腎膜下移植ICCs治療糖尿病NOD-Scid小鼠腹腔內(nèi)注射streptozotocin腎膜下移植含類β細(xì)胞的ICCs高血糖

注射STZ前注射STZ后

移植ICCS后

302010

血糖水平(mmol/l)

注射后3天小鼠出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖癥

移植4天后小鼠血糖明顯下降第42頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

insulin糖尿病小鼠腎膜下移植ICCs后形態(tài)觀察

免疫組化方法檢測(cè)含胰島素細(xì)胞

左腎移植部位

移植后40天，移植部位血管增生免疫組化顯示移植部位的胰島素陽性細(xì)胞第43頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三移植ICCs后血糖明顯下降(P<0.05)

糖尿病小鼠腎膜下移植ICCs后血糖水平測(cè)量STZ處理3天后所有NOD-Scid小鼠出現(xiàn)高血糖，移植4天后小鼠血糖水平下降至接近正常并保持穩(wěn)定至40天，未移植的小鼠保持高血糖。第44頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

移植40天后，移植物在移植部位發(fā)生異常增殖并侵入腎實(shí)質(zhì)，形成導(dǎo)管、細(xì)胞團(tuán)、血管等結(jié)構(gòu)。正常NOD-Scid小鼠腎膜下移植ICCs

移植部位的組織切片H.E染色第45頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

腎膜下區(qū)域侵入腎實(shí)質(zhì)區(qū)域

**renaltubule

正常NOD-Scid小鼠腎膜下移植ICCs

移植部位透射電鏡觀察

可見導(dǎo)管和細(xì)胞團(tuán)

腎小管附近可見導(dǎo)管和血管第46頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三47

這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：移植的ICCs可在糖尿病小鼠體內(nèi)特殊環(huán)境下進(jìn)一步分化生成更多類β細(xì)胞，合成和分泌適量胰島素，能顯著降低血糖水平。但在正常小鼠中能多向分化、異常增殖。第47頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三48討論

1,糖尿病小鼠體內(nèi)微環(huán)境對(duì)ICCs的定向誘導(dǎo)分化作用，可能使糖尿病的干細(xì)胞治療成為可能。

在體內(nèi)誘導(dǎo)較體外徹底，β細(xì)胞比例高于體外，能顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，說明糖尿病小鼠體內(nèi)特殊環(huán)境有利于ICCs向β細(xì)胞分化。（1）糖尿病小鼠的血清可作為胰腺干細(xì)胞體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)因子，其中高濃度葡萄糖和胰高血糖素樣肽1(GLP-1)起主要作用。（2）移植部位血管增生，為生長和分化提供營養(yǎng)並有