病原生物與免疫學實驗教材 實驗五教學課件

實驗五

腸道桿菌實驗內容操作肥達試驗示教糞便腸道致病菌的分離和鑒定實驗目的熟悉肥達試驗的操作方法、結果觀察及分析熟悉腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基上的生長特點了解糞便標本腸道桿菌的分離鑒定肥達試驗(WidalTest)原理：用已知傷寒沙門菌O、H抗原，以及甲型副傷寒、肖氏沙門菌、希氏沙門菌H抗原的診斷菌液與受檢血清作定量凝集試驗，測定受檢血清中有無相應抗體及其效價的試驗。用途：輔助診斷傷寒，副傷寒方法：取小試管32支，分成4排，每排8支，依次標號。于小試管內各加入0.5ml生理鹽水。在每一排第1管中各加患者血清0.5ml，吸打混勻，吸取0.5ml加入第2管作對倍稀釋……依次稀釋至第7管棄去0.5ml，第8管為對照。2~3排按同法稀釋。按8.7.…1列的順序，分別對第1排各管加入傷寒H抗原0.5ml；第2排各管加入O抗原0.5ml；同樣對第3排各管加甲型副傷寒（PA）H抗原0.5ml；第4排各管加乙型副傷寒（PB）H抗原0.5ml。將各管混勻，置37℃水浴箱中16~18小時后觀察結果。肥達試驗結果觀察根據(jù)凝集反應的強弱，分別以“++++、+++、++、+”記錄：++++：液體清澈透明，菌體全部被凝成塊，沉于管底。+++：液體較透明，大部分菌體被凝集而沉于管底。++：液體稍透明，管底有少量凝集沉淀物。+：液體較混濁，可見極少量凝集物。-：液體混濁，細菌因重力下降于管底呈邊緣光滑圓點（與對照管相似）。血清效價（或滴度）：能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見的明顯凝集（即“++”凝集）的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為血清的效價。血清的效價代表著血清中抗體的含量，其效價愈高，所含抗體的量愈多。如血清最低稀釋倍數(shù)（1∶40）仍無凝集，則視為陰性或效價低于1∶40；如血清的最高稀釋倍數(shù)（1∶1280）仍完全凝集，則示血清效價高于1∶1280。糞便標本腸道桿菌的分離鑒定克氏雙糖鐵培養(yǎng)基尿、靛、動培養(yǎng)基分析結果SS平板EMB平板挑取可疑菌落玻片凝集試驗糞便SS平板－分離腸道病原菌的強選擇培養(yǎng)基成分和作用：基礎培養(yǎng)基：提供氮源和碳源膽鹽、枸櫞酸鈉、煌綠：可抑制腸道非致病菌的生長，而對腸道致病菌抑制作用弱。乳糖，中性紅（pH6.8-8.0，紅→橙黃）：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨產(chǎn)生堿性物質→菌落淡黃色；大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸，菌落呈紅色病原菌:小,無色,半透明非致病菌:大,紅色EMB（EosinMethylBlue)平板－分離腸道病原菌的弱選擇培養(yǎng)基成分和作用：基礎培養(yǎng)基：提供氮源和碳源伊紅、美藍：可抑制腸道非致病菌的生長，而對腸道致病菌抑制作用弱。乳糖，伊紅、美藍：致病菌不分解乳糖→菌落無色半透明；大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸，菌落呈紫黑色病原菌:半透明,無色非致病菌:紫黑色克氏雙糖鐵培養(yǎng)基接種方法如何觀察上層含乳糖部分乳糖發(fā)酵：致病菌紅色，非致病菌黃色H2S然后觀察下層發(fā)酵葡萄糖（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）動力乳糖硫酸亞鐵固體葡萄糖半固體指示劑:酚紅

乳糖葡萄糖硫化氫尿素靛基質動力大腸桿菌黃色

+

--++痢疾桿菌紅色

+

--+/--傷寒桿菌紅色

+

+/---+副傷寒桿菌紅色+