熱原檢查法（兔法）

文件編號(hào)熱原檢查法（兔法）頒發(fā)部門XXXXXXX/X總頁數(shù)執(zhí)行日期編制者審核者批準(zhǔn)者編制日期審核日期批準(zhǔn)日期目的：建立產(chǎn)品中熱原檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。范圍：產(chǎn)品的熱原檢查。責(zé)任：質(zhì)量監(jiān)督部。內(nèi)容：本法適用于《中國藥典（2010年版）》附錄中“熱原檢查法—兔法”。4.1實(shí)驗(yàn)材料及用具：4.1.1天平：精度0.01或0.1mg供試品稱量用精度0.1或1mg試劑稱量用精度10g家兔稱重用4.1.2電熱干燥箱：（50-300±1）℃。4.1.3恒溫水浴：（37-100±0.5）℃。4.1.4熱原測溫儀或肛門體溫計(jì)，精度0.1℃。4.1.5家兔固定盒：盒的兩側(cè)有通氣孔。4.1.6實(shí)驗(yàn)用具：注射器、燒杯、三角瓶、大稱量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、廣口試劑瓶、金屬制密封器（均需去熱原）、時(shí)鐘、直鑷、脫脂棉或細(xì)軟衛(wèi)生紙。4.1.7試劑：75％乙醇、凡士林或50％甘油、新蒸餾水（4小時(shí)內(nèi)蒸餾）、滅菌注射用水（經(jīng)熱原檢查，3只家兔中體溫升高0.4℃的最多只有1只，且3只家兔體溫升高總數(shù)低于1℃，或經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，含細(xì)菌內(nèi)毒素低于0.5EU／m1）、無熱原氯化鈉（經(jīng)250℃30分鐘或200℃1小時(shí)或180℃2小時(shí)加熱除熱原）。4.2溶液配制：供試品溶液。4.2.1原料藥：4.2.1.1精密稱取適量，置燒懷、三角瓶或稱量瓶中。4.2.1.2按規(guī)定濃度，加精密量取的一定量滅菌注射用水，攪拌使溶解。4.2.2注射液：4.2.2.1用75％乙醇棉球消毒安瓶頸部，割開安瓶。4.2.2.2精密量取一定量藥液。4.2.2.3按規(guī)定濃度，加精密量取的一定量滅菌注射用水，混勻。4.2.3注射用生理鹽水：4.2.3.1稱取無熱原的氯化鈉適量至燒杯或三角瓶中。4.2.3.2加入供試品“注射用水”適量，配成0.9％的等滲溶液。4.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4.3.1健康無傷、體重1.7-3.0kg、同一來源、同一品系家兔，雌兔應(yīng)無孕，一兔一籠，標(biāo)兔號(hào)。4.3.2新兔預(yù)選：4.3.2.1新兔經(jīng)飼養(yǎng)7日后，進(jìn)行預(yù)測體溫，測溫的條件與熱原檢查要求相同。4.3.2.2測量體溫時(shí)，測溫儀探頭或肛門計(jì)插入肛門的深度各兔應(yīng)相同約6cm，測溫時(shí)間不得少于1.5分鐘。4.3.2.3每1小時(shí)測溫一次，共4次。4.3.2.44次體溫均在38.0-39.6℃（一般多選用38.4-39.4℃）的范圍內(nèi)，且溫度最高最低差數(shù)不超過0.4℃（以不超過0.35℃為佳）的家兔，可供3周內(nèi)實(shí)驗(yàn)用。4.3.2.5錄選新兔編號(hào)、登記入兔史記錄卡，未被錄選家兔，可飼養(yǎng)7日再予測體溫1次，如仍不符合要求則淘汰。4.3.3家兔的重復(fù)使用：4.3.3.1供試品判定為符合規(guī)定的家兔，至少應(yīng)休息2日，方可供下一次實(shí)驗(yàn)用。4.3.3.2供試品判定為需重復(fù)實(shí)驗(yàn)的家兔，應(yīng)暫做休息處理，如重復(fù)合格，升溫≥0.6℃的家兔，應(yīng)重新測溫挑選。4.3.3.3供試品判定為不符合規(guī)定的家兔，一般不再使用。如其組內(nèi)家兔平均升溫未達(dá)0.8℃且已休息兩周以上，可重新測體溫，合格者可用。4.3.3.4每一家兔的使用次數(shù)，最多為10次，體重逐漸減輕或超過3.0kg的家兔，不再使用。4.3.4復(fù)試用家兔：挑選體重在2.O-2.4kg、正常體溫在38.8-39.2℃、使用過2-3次的家兔進(jìn)行試驗(yàn)。4.4試驗(yàn)前的準(zhǔn)備4.4.1測溫儀或肛門溫度計(jì)每3-6個(gè)月校驗(yàn)一次，不符合要求者不能使用。4.4.2用具的除熱原：清洗干凈的玻璃器皿、注射器、針頭、直鑷等放入金屬制容器內(nèi)，密閉，置電熱干燥箱中經(jīng)250℃30分鐘或200℃1時(shí)或180℃2小時(shí)加熱除熱原。去除熱原未曾開啟的密封容器內(nèi)用具，可供一周內(nèi)使用。4.4.3實(shí)驗(yàn)室的溫度：4.4.3.1實(shí)驗(yàn)室的溫度應(yīng)在17-28℃范圍內(nèi)。4.4.3.2實(shí)驗(yàn)室與飼養(yǎng)室的溫度相差不得大于5℃。4.4.3.3試驗(yàn)全過程中，室溫變化不得大于3℃。4.5檢查法：4.5.1選符合規(guī)定的家兔，停止給飼料和水，稱重后置于家兔固定盒內(nèi)至少1小時(shí)。4.5.2每隔30分鐘或1小時(shí)測量家兔體溫1次，一般測量2次，兩次體溫之差不得超過0.2℃，以此兩次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。4.5.3當(dāng)日使用的家兔，正常體溫應(yīng)在38.2-39.6℃范圍內(nèi)，且各兔間查差不得超過1℃。4.5.4每個(gè)供試樣品用家兔3只，再測定正常體溫后15分鐘內(nèi)給藥。4.5.4.1供試品的劑量，應(yīng)按該藥項(xiàng)下的規(guī)定注射，未規(guī)定劑量的藥品，可根據(jù)該藥的藥理性質(zhì)，在不影響家兔正常生理的前提下，按體重計(jì)算（人按50kg計(jì)），用臨床一次劑量的3-10倍。4.5.4.2供試品注射的體積，按家兔體重每kg不少于1ml，不大于10ml。體積在5-10ml/kg的溶液應(yīng)在37-38℃預(yù)熱后注射。4.5.4.3供試品配制完畢后，應(yīng)在30分鐘內(nèi)注射于家兔體內(nèi)。4.5.4.4注射前，先用75％乙醇棉球輕擦耳靜脈的注射部位，從耳尖端靜脈進(jìn)針，如進(jìn)針不利，應(yīng)順序向前進(jìn)行。4.5.4.5注射完畢，撥出針頭時(shí)，按住針孔數(shù)秒鐘，止血。4.5.4.6需緩慢注射的藥液，注射時(shí)間一般每兔不超過3分鐘。4.5.4.7個(gè)別肌注品種，測溫時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長2-3小時(shí)。4.5.5給藥后每隔1小時(shí)測量體溫1次，共3次。4.5.6溫差計(jì)算：4.5.6.1注射藥液后，以3次測得體溫中最高的一次減去正常體溫，為該兔體溫的升高度數(shù)，如3次體溫低于正常體溫，則升溫度數(shù)以“0”計(jì)。4.5.6.23次體溫中最低的一次，減去正常體溫，即為降溫值。4.6結(jié)果判斷：4.6.1判斷復(fù)試：4.6.1.l初試3只家兔中僅有1只體溫升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔升溫均低于0.6℃但升溫的總數(shù)達(dá)1.4℃或1.4℃以上，應(yīng)另取5只家兔復(fù)試。4.6.1.2含有熱原的供試品，一般在給家兔靜脈注射后1-2小時(shí)出現(xiàn)升溫高峰，當(dāng)?shù)?小時(shí)升溫≥0.6℃時(shí)，宜復(fù)試后再作判斷。4.6.1.33只家兔中有1只降溫值≥0.6℃時(shí)，宜復(fù)試后再作判斷。4.6.2判斷合格：4.6.2.1初試3只家兔中，體溫升高均在0.6℃以下，并且3只家兔升溫的總數(shù)在1.4℃以下可判斷為符合規(guī)定。4.6.2.2復(fù)試5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔數(shù)僅有1只，并且初復(fù)試合并，8只家免的升溫總數(shù)為3.5℃或3.5℃以下，可判斷為符合規(guī)定。4.6.3判斷不合格：4.6.3.1初試3只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔數(shù)有2只或2只以上，可判斷為不符合規(guī)定。4.6.3.2復(fù)試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0