DXD-1菌體細(xì)胞的凝聚性成因及初步研究方案,細(xì)胞生物學(xué)論文

DXD-1菌體細(xì)胞的凝聚性成因及初步研究方案,細(xì)胞生物學(xué)論文在液體培養(yǎng)基中，DXD-1很容易出現(xiàn)菌體細(xì)胞的團(tuán)圓現(xiàn)象，對于具有凝集性質(zhì)的發(fā)酵菌體來講，凝集性使菌體能在發(fā)酵結(jié)束時迅速沉淀，可降低分離菌體所耗的能源，但同時菌團(tuán)的構(gòu)成在一定程度上也會阻礙氧氣以及營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)送，使得菌團(tuán)內(nèi)部的細(xì)胞處于缺氧以及營養(yǎng)不良的狀態(tài)，進(jìn)而影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。所以討論DXD-1菌體細(xì)胞的凝聚性有利于優(yōu)化菌體發(fā)酵合成代謝產(chǎn)物的能力，有利于進(jìn)一步了解DXD-1菌體特性。2、菌體細(xì)胞凝聚的成因很多真菌在搖瓶培養(yǎng)時都容易聚集成團(tuán)，靜置后沉淀下來，所呈現(xiàn)出的顏色和形狀會隨菌種、培養(yǎng)基成分、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速的不同而不同。這種現(xiàn)象能否與外界環(huán)境條件的變化影響菌體細(xì)胞分泌出一定的物質(zhì)造成細(xì)胞集聚性的改變有關(guān)?菌體細(xì)胞本身怎樣影響其凝聚性?對于大多數(shù)真菌來講當(dāng)前還未見與此有關(guān)的詳盡報道。能夠肯定的是菌體細(xì)胞凝集與細(xì)胞周質(zhì)成分密不可分。當(dāng)下與菌體細(xì)胞周質(zhì)有關(guān)的研究主要集中在凝集素、絮凝性微生物和生物被膜方面。2.1凝集素凝集素是一類能促使細(xì)胞凝集的糖蛋白，它與糖的非共價結(jié)合是專一的、可逆的。它廣泛存在于自然界中，存在于各種動植物和微生物的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中。2.1.1凝集素的生物學(xué)效應(yīng)凝集素需要與凝集素受體特異性結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。凝集素受體主要由糖蛋白組成，少數(shù)為糖脂或其他糖化物，一般位于細(xì)胞膜上。凝集素受體一旦與相應(yīng)凝集素結(jié)合就會發(fā)生空間構(gòu)型的變化．引起受體特性的改變，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，如細(xì)胞凝集、儲存能量、抗病害、專一性辨別等。2.1.2凝集素的提取分離工藝當(dāng)前凝集素以及凝集素單體的提取和分離純化都是按照蛋白質(zhì)的提早分離方式方法進(jìn)行的，一般先將提取物經(jīng)硫酸銨分級沉淀后，再用離子交換樹脂或親和色譜來純化。李延清等用PBS緩沖液從馬鈴薯中提取凝集素粗提液。郭春生等采用生理鹽水和磷酸緩沖液對蕓豆浸提后用硫酸銨沉淀獲得蕓豆植物凝集素。袁燕等提取蒜頭中的凝集素采用的是硫酸銨分段鹽析法，而張濤等共沉淀紅蕓豆和甲狀腺球蛋白的粗提取液后進(jìn)行超濾可制備高純度的紅細(xì)胞凝集素，具有高效，高產(chǎn)品純度和高活力的特點(diǎn)。2.2絮凝性微生物微生物絮凝劑也屬于微生物次生代謝產(chǎn)物中的一種，這種次生代謝產(chǎn)物具有絮凝活性。絮凝性微生物的菌體細(xì)胞本身通常能相互粘附構(gòu)成絮狀沉淀而到達(dá)分離的目的。釀酒酵母是典型的能使本身細(xì)胞發(fā)生凝聚的微生物，它的凝聚特性研究能夠作為DXD-1菌體的借鑒。2.2.1釀酒酵母的凝聚特性酵母細(xì)胞凝聚的形式有3種：(1)酵母細(xì)胞芽殖時與母細(xì)胞連成細(xì)胞鏈構(gòu)成凝聚。(2)酵母細(xì)胞有性繁衍時通過外表特殊的蛋白連接構(gòu)成凝聚。(3)酵母細(xì)胞之間通過細(xì)胞壁上的特定蛋白與甘露糖殘基的專一性結(jié)合構(gòu)成的無性絮凝。該特定蛋白類似于外源凝集素，被稱為絮凝素，編碼絮凝素的基因稱為絮凝基因。2.2.2酵母絮凝的影響因素影響絮凝的因素除了菌株本身還有很多非遺傳因素。如細(xì)胞壁成分、細(xì)胞外表特性、培養(yǎng)時間、接種量、營養(yǎng)成分、溶氧、溫度、蛋白質(zhì)變性劑、無機(jī)離子、細(xì)胞間互相作用力等。以往的研究結(jié)果表示清楚，防止微生物絮凝在某些程度上能促進(jìn)微生物的生長，原因是增加了游離細(xì)胞與培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積。絮凝不是微生物生命活動所必需的，有可能只是為了應(yīng)對外界環(huán)境的變化而構(gòu)成。2.3生物被膜生物被膜是指菌體在繁衍、分化時由本身分泌的多糖基質(zhì)及各種蛋白在細(xì)胞外表高度組織化系統(tǒng)化聚集所構(gòu)成的膜樣聚合物。當(dāng)前研究較多的是細(xì)菌生物被膜和有害真菌的生物被膜。生物被膜是菌體在惡劣環(huán)境中構(gòu)成的一種保衛(wèi)機(jī)制，被生物被膜包裹的菌體通常會由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而生長緩慢。2.3.1生物被膜的鑒定生物被膜的組成成分復(fù)雜且差異較大，常含有多糖基質(zhì)、代謝產(chǎn)物及環(huán)境中特殊物質(zhì)或碎屑等。細(xì)菌生物被膜的鑒定方式方法通常有試管法、銀染法、掃描和透射電鏡法、激光共聚焦掃描顯微鏡法和微量板定量檢測法等，這些方式方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。2.3.2生物被膜的解離生物被膜一旦構(gòu)成就很難去除，生物被膜若發(fā)生解離通常有兩種情況：(1)環(huán)境變化不利于微生物的生存，引發(fā)微生物的死亡。(2)環(huán)境變化更有利于微生物的快速生長。當(dāng)前生物被膜的降解只要通過菌體本身產(chǎn)生的特異性降解酶來進(jìn)行，還沒有其它有效的人工方式方法。3、DXD-1菌體細(xì)胞凝聚的初步研究方案在當(dāng)前對細(xì)胞周質(zhì)物質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，初步確定研究DXD-1菌體細(xì)胞凝聚的方式方法如下：3.1確定菌體細(xì)胞絮凝成分的大致類型對DXD-1菌體細(xì)胞周質(zhì)成分進(jìn)行分析，凝聚素多是糖蛋白，而生物被膜則多是成分復(fù)雜的混合物。能夠先用幾種簡單的蛋白酶處理凝聚著的DXD-1菌體，假如菌體很容易分散則多是凝集素。假如凝聚程度沒明顯變化則進(jìn)行生物被膜的分析方式方法。3.2構(gòu)成生物被膜引起凝聚的研究方案3.2.1優(yōu)化DXD-1菌體培養(yǎng)條件假如絮凝原因是由于菌體構(gòu)成了生物被膜，則證明培養(yǎng)條件可能不適宜菌體生長。鑒于生物被膜成分的復(fù)雜性，優(yōu)化培養(yǎng)條件是解決絮凝因素的主要途徑。3.2.2揣測真菌生物被膜構(gòu)成機(jī)制現(xiàn)有的研究成果表示清楚，在生物被膜內(nèi)，菌體之間存在著信息傳遞。菌體分泌胞外復(fù)合物構(gòu)成完好生物被膜構(gòu)造是某些基因被信息分子活化的結(jié)果。探明這些基因的序列及影響表示出調(diào)控的因素具有重要意義，對DXD-1進(jìn)行分子生物學(xué)研究能夠了解真菌生物被膜的構(gòu)成機(jī)制。3.2.3有益菌生物被膜的進(jìn)一步研究微生物的生物被膜具有較強(qiáng)的抗逆性，能抑制金屬腐蝕，能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，能夠構(gòu)成生物外表活性素保衛(wèi)植物免受病原菌損害，作為污水處理中生物被膜反響器，研究生物被膜的開發(fā)和應(yīng)用在當(dāng)代工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有重要的意義。當(dāng)前生物被膜的研究對象大多是有害菌，關(guān)于對有益菌的生物被膜的研究還很少見，DXD-1作為能產(chǎn)油脂的對環(huán)境友好的有益微生物，有望成為生產(chǎn)生物被膜的儲備菌。3.3凝集素造成菌體凝聚的研究方案(1)按凝集素的提取方式方法粗凝集素液，配制凝集素提取緩沖液浸泡離心后的菌體一段時間后再離心得到粗提液。將此粗提液采用透析方式方法濃縮后參加到分散的酵母細(xì)胞或動物紅細(xì)胞中觀察能否出現(xiàn)凝集反響。(2)對該粗提液做糖抑制實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)可考察與凝集素糖蛋白結(jié)合的糖的種類，進(jìn)而能夠揣測出發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)過不同碳源對菌體細(xì)胞凝聚的影響。(3)對該粗提液進(jìn)行成分分析。SDS電泳分析凝集素的分子量，并用色譜或質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)和糖的種類，以確定凝集素成分。(4)利用基因工程的手段參照已有的酵母絮凝基因研究方式方法構(gòu)建DXD-1絮凝基因組文庫.從文庫中挑選重組子獲得表示出絮凝活性的克隆子，并進(jìn)行序列分析得到DXD-1的絮凝基因。(5)對所獲得的DXD-1絮凝基因進(jìn)行遺傳改造，使絮凝基因失活或控制絮凝基因只在發(fā)酵結(jié)束時表示出，而不在發(fā)酵的早期及中期表示出。實(shí)驗(yàn)室已有的研究表示清楚DXD-1是一株高產(chǎn)油真菌，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。其凝聚特性在一定程度上阻礙了發(fā)酵的進(jìn)行。鑒于當(dāng)前釀酒酵母絮凝特性的研究和在工業(yè)上的應(yīng)用，有望解決DXD-1在發(fā)酵經(jīng)過中絮凝的缺點(diǎn)，并借助基因工程的手段賦予DXD-1在發(fā)酵后期表示出誘導(dǎo)型絮凝基因的能力，以方便在工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵后期菌體的分離和回收利用。以下為參考文獻(xiàn)：[1]潘進(jìn)權(quán)，劉耘．菌絲結(jié)團(tuán)問題的討論[J]．中國釀造，2002(4)：33-34．[2]戴聰杰．甲殼動物血清中凝集素對微生物細(xì)胞的凝集性能[J]．海洋科學(xué)，2003，27(10)：63-67．[3]趙寅生．凝集素生物學(xué)功能及應(yīng)用[J]．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，28(4)：445-447．[4]侯玉芳，李繼昌，張德顯，等．凝集素的提取純化及其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用[J]．中國獸醫(yī)雜志，2018，46(2)：62-64．[5]李延清，孫志宏，劉長海，等．馬鈴薯凝集素的凝集作用及其影響因素[J]，黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004(8)：71-72．[6]郭春生，于蕾妍，葛蔚等蕓豆植物凝集素的提取及