純化的小熊貓重組IFN-γ免疫活性鑒定,動(dòng)物學(xué)論文

純化的小熊貓重組IFN-γ免疫活性鑒定,動(dòng)物學(xué)論文干擾素(IFN-)由NK細(xì)胞、活化的Th1和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTcells,CTL)等細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-的免疫學(xué)活性主要表如今如下幾個(gè)方面:促進(jìn)NK細(xì)胞活性;加強(qiáng)巨噬細(xì)胞遞呈抗原及其殺菌功能;誘導(dǎo)活化的B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a和IgG3;通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子T-bet表示出促進(jìn)Th1的分化;通過(guò)抑制Th2分化,促進(jìn)CTL活化,激活巨噬細(xì)胞等途徑極化機(jī)體的細(xì)胞免疫功能;提高M(jìn)HCⅡ類分子在抗原遞呈細(xì)胞外表的表示出量;直接抑制病毒復(fù)制效應(yīng)。因而,IFN-是天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答經(jīng)過(guò)中很重要的細(xì)胞因子之一,在機(jī)體抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌、抗病毒以及抗腫瘤中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?；诖?人工制備重組IFN-并將其應(yīng)用于動(dòng)物傳染病和腫瘤治療,已經(jīng)在獸醫(yī)臨床獲得了較好的效果。人工舍飼養(yǎng)殖小熊貓經(jīng)過(guò)中,因細(xì)菌、病毒和寄生蟲等感染引起的小熊貓死亡問(wèn)題一直令人感到棘手,至今未有較為合理有效的應(yīng)對(duì)措施。本研究以純化的小熊貓重組IFN-為材料,對(duì)其免疫活性進(jìn)行鑒定,為小熊貓傳染病及腫瘤的預(yù)防和治療提供新的手段。1、材料與方式方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)用動(dòng)物成年健康小熊貓6只(2只雌性,4只雄性),飼養(yǎng)于海峽(福州)大熊貓研究溝通中心。1.1.2主要試劑淋巴細(xì)胞分離液為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品;ConA、Hepes、L-Gln、MTT和丙酮酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品;犢牛血清為Gibco公司產(chǎn)品;-巰基乙醇,DMSO為Amresco公司產(chǎn)品;青、鏈霉素,肝素鋰抗凝管,小熊貓IFN-原核表示出蛋白(純化后凍干),NaHCO3,NaCl,KCl,Na2HPO412H2O,KH2PO4均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-HRP),碳酸鹽緩沖液,洗滌緩沖液(PBST),封閉液(含50g/L脫脂奶粉的PBST),終止液(2mol/L的H2SO4),96孔酶標(biāo)板。1.1.3主要儀器水平轉(zhuǎn)子離心機(jī),角轉(zhuǎn)子離心機(jī)(eppendorf),超凈工作臺(tái),酶標(biāo)儀(BIO-RAD),CO2培養(yǎng)箱(Thermo),恒溫培養(yǎng)箱,普通光學(xué)顯微鏡,普通冰箱,-70℃超低溫冰箱。1.2方式方法1.2.1小熊貓外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備前肢靜脈無(wú)菌采小熊貓外周血3mL,肝素抗凝。將抗凝血沿離心管壁緩慢疊加到3mL淋巴細(xì)胞分離液上,注意盡量不要讓血液與淋巴細(xì)胞分離液的分界面晃動(dòng)。2000r/min離心20min。汲取云霧層細(xì)胞到另一干凈離心管中,參加兩倍體積的PBS(含20mL/L犢牛血清),溫和顛倒混勻,1000r/min10min洗滌細(xì)胞,棄上清。重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。最后一次洗滌結(jié)束后,棄掉上清,利用臺(tái)盼藍(lán)染色法染色,3min內(nèi)計(jì)數(shù),活細(xì)胞數(shù)目要求在95%以上。用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1107個(gè)/mL。1.2.2淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)汲取100L細(xì)胞懸液參加到96孔培養(yǎng)板中,試驗(yàn)組參加100L不同濃度(1001.56、10-11.56、10-21.56、10-31.56、10-41.56、10-51.56mg/mL)的小熊貓IFN-原核表示出蛋白或經(jīng)熱變性處理(煮沸10min)的小熊貓IFN-原核表示出蛋白(10-11.56mg/mL)。對(duì)照組參加100L的完全1640培養(yǎng)液。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。細(xì)胞培養(yǎng)至68h時(shí),每孔無(wú)菌汲取50L上清棄掉,參加15LMTT。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。細(xì)胞培養(yǎng)72h時(shí),每孔汲取100L上清棄掉,參加100LDMSO徹底裂解細(xì)胞,用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值,計(jì)算SI值,確定出最佳刺激效果的稀釋梯度。1.2.3PBMC培養(yǎng)上清的制備分離小熊貓外周血單個(gè)核細(xì)胞(periphalbloodmononuclearcells,PBMC),步驟同1.2.1,用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1107/mL。汲取500L細(xì)胞懸液參加到24孔培養(yǎng)板中,再參加500L濃度為10-11.56mg/mL的小熊貓IFN-原核表示出蛋白溶液,另設(shè)PBMC陰性對(duì)照。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)。分別在刺激后12、24、36、48、60、72h收取細(xì)胞上清,置-80℃保存,供IFN-測(cè)定使用。1.2.4IFN-的間接ELISA測(cè)定1.2.4.1抗原包被不同時(shí)間收集的PBMCs培養(yǎng)上清凍干粉,用等量的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)溶解,然后以100L/孔包被,另設(shè)相應(yīng)的對(duì)照孔。4℃過(guò)夜,棄去包被液,用PBST洗5次。1.2.4.2封閉每孔參加100L含50g/L脫脂奶粉的PBST,37℃,孵育1h。棄去封閉液,PBST洗滌5次。1.2.4.3加一抗用PBST將兔抗IFN-血清稀釋1000倍,每孔參加100L,37℃,孵育1h。棄去孔中液體,PBST洗滌5次。1.2.4.4加二抗羊抗兔IgG-HRP用PBST稀釋成1∶5000,每孔參加100L,37℃孵育50min。棄去孔中液體,PBST洗滌5次。1.2.4.5每孔參加100L的底物顯色液,37℃孵育15min。1.2.4.6終止參加2mol/L的H2SO4終止反響,測(cè)OD450nm值。2、結(jié)果2.1重組IFN-對(duì)小熊貓PBMC增殖的影響本研究結(jié)果顯示,濃度組為10-11.56mg/mL、10-21.56mg/mL的小熊貓IFN-原核表示出產(chǎn)物與小熊貓外周血T淋巴細(xì)胞共孵育后,具有顯著刺激T淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)(P0.05)。為進(jìn)一步明確這種細(xì)胞增殖效應(yīng)是IFN-本身的免疫活性引起的,而非IFN-作為一種抗原性質(zhì)的作用。我們對(duì)IFN-原核表示出產(chǎn)物進(jìn)行了蛋白熱變性處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為10-11.56mg/mL的IFN-經(jīng)熱變性處理后,與空白對(duì)照組相比,其淋巴細(xì)胞增殖效果無(wú)顯著差異(P0.05),但與未經(jīng)熱變性處理組相比,淋巴細(xì)胞增殖效果顯著降低(P0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表示清楚,我們制備的小熊貓IFN-原核產(chǎn)物具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的免疫活性,經(jīng)熱變性處理的小熊貓IFN-刺激T淋巴細(xì)胞增殖的活性幾乎完全喪失(圖1和圖2)。2.2重組IFN-對(duì)小熊貓PBMC分泌IFN-的影響本試驗(yàn)測(cè)定了PBMC在重組IFN-作用下,不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清中IFN-的水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組IFN-含量在60h之前均顯著升高(P0.01,或P0.05)。與對(duì)照組相比,IFN-含量在培養(yǎng)72h時(shí)的水平并沒(méi)有顯著變化(P0.05)。結(jié)果表示清楚,IFN-原核表示出產(chǎn)物具有刺激小熊貓外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-活性。PBMC培養(yǎng)系統(tǒng)參加的重組IFN-在短期內(nèi)(24h)迅速激活Th1和CTL細(xì)胞并分泌IFN-,之后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),效應(yīng)T細(xì)胞活力下降,其分泌能力隨之下降并停止。加之IFN-則在酸性環(huán)境不穩(wěn)定,故而累積在上清中的IFN-則隨時(shí)間延長(zhǎng)而不斷衰減,導(dǎo)致培養(yǎng)后期培養(yǎng)上清中IFN-水平下降(圖3)。3、討論外周血單個(gè)核細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及單核細(xì)胞,經(jīng)過(guò)淋巴細(xì)胞分離液分離后獲得的PBMC主要包括T、B淋巴細(xì)胞和極少量的NK細(xì)胞。T細(xì)胞由Th1、Th2、CTL、Th17等組成,華而不實(shí)Th1、CTL等T細(xì)胞的活化分化均需要IFN-。換言之,IFN-在細(xì)胞培養(yǎng)水平具有刺激T細(xì)胞增殖的效應(yīng),并且這種作用在一定范圍內(nèi)呈量效正相關(guān)的關(guān)系?；罨约靶?yīng)Th1和CTL又具有分泌IFN-活性,在其培養(yǎng)上清中又能夠檢測(cè)到IFN-,并且上清中IFN-水平的高低與活化以及效應(yīng)Th1和CTL數(shù)量嚴(yán)密相關(guān)?；谏鲜雒庖邔W(xué)原理,本研究采用PBMC增殖試驗(yàn)和間接ELISA,分別測(cè)定了重組IFN-刺激小熊貓PBMC增殖及其培養(yǎng)上清中IFN-含量,以此斷定小熊貓?jiān)酥亟MIFN-的免疫活性。本研究在IFN-活性時(shí)之所以不選擇動(dòng)物個(gè)體水平試驗(yàn),基于兩個(gè)原因:小熊貓屬于國(guó)家珍稀保衛(wèi)動(dòng)物,數(shù)量有限;正常小熊貓個(gè)體使用重組IFN-效果未必明顯,病毒感染或荷瘤小熊貓樣本短時(shí)間內(nèi)難以獲得。除此之外,也有研究采用IFN-直接抗病毒增殖的特點(diǎn),通過(guò)測(cè)定其在細(xì)胞培養(yǎng)水平抑制病毒增殖效果來(lái)評(píng)估的活性。作為免疫活性細(xì)胞因子,其更重要更明顯的活性是具體表現(xiàn)出在其免疫學(xué)方面,這也是本研究不測(cè)定重組IFN-抗病毒增殖活性的原因。本研究結(jié)果表示清楚,純化的小熊貓重組IFN-具有較好的免疫活性,能夠刺激小熊貓T淋巴細(xì)胞增殖及促進(jìn)其分泌IFN-。從培養(yǎng)上清中IFN-含量分析,在12h時(shí)含量就已經(jīng)明顯升高,提示在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞已經(jīng)充分活化。換言之,我們?cè)谂囵B(yǎng)系統(tǒng)中參加的重組在12h之前就已經(jīng)發(fā)揮了其刺激T細(xì)胞增殖的作用,這和我們前期預(yù)試驗(yàn)在12h就能夠觀察到PBMC有細(xì)胞大量增殖構(gòu)成的克隆團(tuán)現(xiàn)象恰好吻合。由于一般的蛋白質(zhì)抗原在PB-MC細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中刺激淋巴細(xì)胞增殖構(gòu)成克隆團(tuán)現(xiàn)象通常需要24h,因而,本研究結(jié)果充分表示清楚,我們制備的小熊貓重組IFN-具有很好的免疫活性。為進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論,我們對(duì)小熊貓重組IFN-根據(jù)蛋白質(zhì)熱熱變性條件進(jìn)行處理,再將熱變性的重組IFN-參加到PBMC培養(yǎng)系統(tǒng)中,結(jié)果顯示其刺激細(xì)胞增殖的活性消失。表示清楚重組IFN-活性的發(fā)揮需要特定空間構(gòu)象的維持,這與天然IFN-活性需要特定構(gòu)象的特性相一致。本研究結(jié)果證明,一旦該重組細(xì)胞因子的空間構(gòu)象被毀壞,其免疫活性也就隨之喪失。這一結(jié)論為下一步制備供小熊貓臨床應(yīng)用的重組IFN-提供了極有參考價(jià)值的根據(jù)。人類I