Percoll 分離細(xì)胞的學(xué)習(xí)資料

Percoll分離細(xì)胞的學(xué)習(xí)資料第1頁(yè)/共15頁(yè)密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，中間或底層，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。離心力，離心時(shí)間和離子轉(zhuǎn)子因介質(zhì)和被分離物而已。介質(zhì)(media)的要求：

1.能產(chǎn)生密度梯度

2.密度高時(shí)，粘度不高

3.pH中性或易調(diào)為中性

4.濃度大時(shí)滲透壓不大

5.對(duì)細(xì)胞無(wú)毒第2頁(yè)/共15頁(yè)梯度離心常用介質(zhì)蔗糖(Sucrose)

主要的不足表現(xiàn)為：

1.高滲透壓，密度越高滲透壓越大，易使被分離物在所在的梯度帶因滲透壓不適，而導(dǎo)致被分離物損傷。

2.分子量過(guò)小(342)易使蔗糖滲入到細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)，從而破壞細(xì)胞。

3.高粘性鹽(Salts)

常用的有CsCl,K-tartrate和NaBr,主要不足同蔗糖1，2。多聚蔗糖(Polysucrose)

即所謂的Ficoll,分子量為400000左右，其主要特點(diǎn)為彌補(bǔ)了蔗糖的高滲透壓，但也是密度越高，滲透壓越大。最大的弊端是太過(guò)粘稠，為蔗糖的好幾倍，不易脫糖。

第3頁(yè)/共15頁(yè)碘化物(Iodinatedcompounds)

常用的有：Hypaque(泛影鈉)，Urografin(泛影葡胺),Metrizoate(甲泛影鈉)等?；旌辖橘|(zhì)(Mixedmedia)

常用的有：Ficoll-Paque,Histopaque,Histoprep,Lymphoprep等。硅膠(Colloidalsilica)

即所謂的percoll，“Ofallsubstancestested,nonecameclosertoprovidingallthedesiredcharacteristicsthancolloidalsilica.”

第4頁(yè)/共15頁(yè)P(yáng)ercoll理化特性平均分子量6×106,滲透壓<20mOsm，密度1.13g/ml.pH中性，生理鹽水配制的percoll應(yīng)用液等滲.平均直徑10-30nm.硅膠經(jīng)處理后，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性.（注：硅溶膠對(duì)細(xì)胞有毒性）

主要是在SiO2coated一層聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)

A:0.15MNaCl,35nmB:0.25MSucrose,30nm第5頁(yè)/共15頁(yè)P(yáng)ercoll的使用市售原液

1.100%percoll原液使用時(shí)percoll原液:10×生理鹽水=9:1配制成percoll應(yīng)用液，再用生理鹽水將percoll應(yīng)用液調(diào)制成各個(gè)梯度。

2.已經(jīng)用10×生理鹽水配制好的percoll應(yīng)用液使用時(shí)只需用生理鹽水將percoll應(yīng)用液調(diào)制成各個(gè)梯度即可。梯度設(shè)置

1.Stepgradients(不連續(xù)梯度)第6頁(yè)/共15頁(yè)2.Continuousgradient(連續(xù)梯度)(1)高速離心

(2)梯度混合器第7頁(yè)/共15頁(yè)樣品的放置

1.與percoll液混勻

2.置于梯度頂層

3.置于梯度底層

需用較大的離心力樣品的收集第8頁(yè)/共15頁(yè)P(yáng)ercoll在貝類血細(xì)胞分選上的應(yīng)用SeparationofEuropeanflatoyster,Ostreaedulis,haemocytesbydensitygradientcentrifugationandSDScharacterisationofseparatedhaemocytesub-populations

——QingGangXue,RenaultTristanFish&ShellfishImmunology(2000)10,155–165第9頁(yè)/共15頁(yè)血細(xì)胞樣品處理上Percoll梯度：10%，30%，50%和70%

結(jié)果：10/30%界面處形成一帶(P1)，50/70%界面處也形成一帶(G)。上Ficoll梯度：5%，10%，15%和20%

結(jié)果：5/10%界面處形成一帶(F1)，10/15%界面處也形成一帶(F2)。血細(xì)胞染色SDS第10頁(yè)/共15頁(yè)P(yáng)1G第11頁(yè)