分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的要求與儀器設(shè)備

PAGEPAGE141附錄二分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的要求與儀器設(shè)備生命科學(xué)的飛速發(fā)展孕育了現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，并且已經(jīng)滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，因此在許多學(xué)科如遺傳學(xué)、分類學(xué)、病理學(xué)和醫(yī)學(xué)等均開展了相關(guān)研究。建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室是非常必要的，它主要包括離心機(jī)室、細(xì)胞培養(yǎng)室、儀器分析室、普通實(shí)驗(yàn)室和放射性核素操作室等；一個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的儀器設(shè)備，按用途不同可分為以下幾類：一、離心機(jī)離心技術(shù)是利用物質(zhì)的沉降、浮力和質(zhì)量等差異，在離心力的作用下使其分離、純化和濃縮的一種物理手段。離心技術(shù)廣泛應(yīng)用于收集和分離細(xì)胞、細(xì)胞器和生物大分子等。實(shí)驗(yàn)室中常用的離心機(jī)容量和轉(zhuǎn)速各不相同，主要有：1．低速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000r/min（轉(zhuǎn)/分鐘），離心力60002．高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速25,000r/min，離心力89,0003．超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為120,000r/min，離心力為694,0004．臺(tái)式微量離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)12,000～18,000r/min，有常溫和冷卻兩種類型。適用于小量樣品（如1.5mL）的操作，可極大地縮短離心時(shí)間。主要用于生物大分子的微量操作。二、細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞培養(yǎng)要求無菌操作，所以在細(xì)胞培養(yǎng)室最好設(shè)置獨(dú)立的無菌操作間；如果實(shí)驗(yàn)室條件有限，那么在室內(nèi)走動(dòng)較少的位置設(shè)無菌操作區(qū)，同樣也能滿足要求。1．超凈工作臺(tái)：是不可缺少的無菌操作裝置。其原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣，經(jīng)過高效過濾器后而通過工作臺(tái)面，使實(shí)驗(yàn)操作區(qū)域成為無菌環(huán)境。2．恒溫培養(yǎng)箱：可調(diào)節(jié)溫度，用于細(xì)胞培養(yǎng)。3．CO2培養(yǎng)箱：它能恒定地提供一定量的CO2，通常為5%，用來維持培養(yǎng)液的酸堿度。適用于培養(yǎng)各種細(xì)胞。4．恒溫?fù)u床：配有控溫裝置，用于液體細(xì)菌的培養(yǎng)。5．生化培養(yǎng)箱：既可加熱，又可制冷，用于細(xì)胞培養(yǎng)。6．倒置顯微鏡：用來觀察了解細(xì)胞的生長狀況，最好附帶照相裝置。7．實(shí)體顯微鏡：用于細(xì)胞的觀察和照相。三、分析及檢測儀器1．分光光度計(jì)：分光光度法是基于不同分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對電磁輻射選擇性吸收而建立的分析方法。分光光度計(jì)能利用物質(zhì)在可見光和紫外線區(qū)域中的吸收光譜來鑒定物質(zhì)的性質(zhì)及其含量。實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的大都是紫外與可見光分光光度計(jì)，主要用于核酸的定量和純度檢測。2．電泳儀：可輸出穩(wěn)定的電流（最大250mA）和電壓（高達(dá)2500～3000V，用于測序）。根據(jù)輸出電壓不同，分為常壓、中壓和高壓穩(wěn)壓電泳儀。電泳技術(shù)是檢測和鑒定各種生物大分子的純度、濃度和大小的有力工具，甚至還是分離、純化、回收和濃縮樣品的主要工具之一。電泳裝置包括電泳儀和電泳槽。3．電泳槽：一般有水平和垂直電泳槽兩種。水平電泳槽可用于紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和瓊脂糖凝膠電泳等。垂直電泳槽可用于聚丙烯酰胺凝膠電泳等。4．脈沖場凝膠電泳裝置：與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，脈沖場凝膠電泳采用定時(shí)改變電場方向的交變電源，時(shí)間與電流交替改變，使DNA分子能不斷地調(diào)整泳動(dòng)方向，達(dá)到分離目的，目前該儀器可達(dá)到的最大分辨率為12Mb。為保證實(shí)驗(yàn)效果，該裝置常附加冷卻系統(tǒng)。主要用于原核生物染色體的分離、核型分析、大片段物理圖譜制作、酵母人工染色體的分析、探測細(xì)胞染色體上百萬堿基對以上的基因組DNA的缺失等。5．紫外/可見檢測儀：能提供紫外光和可見光源，用于觀察凝膠條帶。對于核酸，電泳后需要溴化乙錠染色，在紫外光下觀察。使用波長為302nm的紫外燈，靈敏度較高，且對核酸的褪色和斷鏈作用較小。盡量避免長時(shí)間的照射凝膠，否則影響回收DNA片段的質(zhì)量，而且影響觀察和照相效果。輻射式紫外燈對觀察者照射少，而透射式紫外燈的照相效果好，但須佩帶有機(jī)防護(hù)面罩。6．核酸/蛋白凝膠圖像分析系統(tǒng)：該系統(tǒng)包括圖像的攝取、分析、數(shù)據(jù)處理和打印等功能，可應(yīng)用于觀察和拍攝瓊脂糖凝膠、考馬斯亮藍(lán)染膠、銀染膠、雜交膜、放射自顯影片和熒光顯影膠片等。利用該系統(tǒng)，可以得到最佳的圖像質(zhì)量并對結(jié)果進(jìn)行定性和定量分析，如自動(dòng)計(jì)算分子量和濃度、斑點(diǎn)自動(dòng)識(shí)別和質(zhì)量計(jì)算、密集條帶識(shí)別和分析等。7．凝膠干燥儀：能將電泳后的凝膠進(jìn)行脫水干燥，便于保存。8．PCR儀：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是用于在體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的快速方法，通過不同溫度下進(jìn)行的DNA變性、引物復(fù)性和延伸等過程的循環(huán)，使靶序列DNA片段以指數(shù)級(jí)數(shù)積累。PCR儀又稱為DNA熱循環(huán)儀、基因擴(kuò)增儀，在基因工程研究中廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)外許多廠家都生產(chǎn)PCR儀，各類儀器的溫度控制有所不同：（1）液體加熱和冷卻；（2）電阻加熱，液體冷卻；（3）電阻加熱，半導(dǎo)體致冷。利用熒光定量PCR儀可以進(jìn)行定量分析。9．電穿孔儀：1988年Dower等人用電激法（electroporation）成功轉(zhuǎn)化細(xì)菌，其原理是在高壓電脈沖的作用下，使細(xì)胞膜上暫時(shí)出現(xiàn)微孔，從而將生物大分子如DNA、RNA、蛋白等導(dǎo)入動(dòng)物、植物或微生物體內(nèi)。通過各種參數(shù)的優(yōu)化，如電場強(qiáng)度、電脈沖長度、電容和電阻等，可提高轉(zhuǎn)化率。與化學(xué)轉(zhuǎn)化方法相比，電激法轉(zhuǎn)化細(xì)菌操作簡單，重復(fù)性好，轉(zhuǎn)化效率高。10．基因槍：基因槍技術(shù)是一種將核酸直接發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)的物理學(xué)方法，應(yīng)用于包括培養(yǎng)細(xì)胞、組織、器官、植物、動(dòng)物、細(xì)菌和細(xì)胞器官等各種不同的目標(biāo)。11．DNA合成儀：DNA合成就是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用化學(xué)合成方法進(jìn)行基因或寡核苷酸片段的人工合成，目前已發(fā)展出的方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法以及后二者結(jié)合的固相合成法和自動(dòng)化法。DNA合成儀的基本工作原理是，將待合成的DNA片段第一個(gè)核苷酸的3’-OH直接固定于惰性的固相載體上，然后從該核苷酸開始與下一個(gè)核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)后通過洗滌除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物。重復(fù)進(jìn)行以上步驟，每一次循環(huán)都加入一個(gè)核苷酸，一般一個(gè)循環(huán)只需幾分鐘，合成的鏈?zhǔn)冀K被固定在固相載體上。當(dāng)鏈長達(dá)到所需長度后，將寡核苷酸鏈從固相載體上切除下來，并洗脫保護(hù)基，經(jīng)純化得到所需的寡核苷酸片段。目前化學(xué)合成寡核苷酸片段的能力一般在150～200bp，它主要用作合成基因的元件、核苷酸序列分析的引物、連接時(shí)使用的連接子和接頭、核酸分子雜交探針和基因定點(diǎn)誘變研究等。12．DNA測定儀：DNA自動(dòng)測序技術(shù)在80年代以來迅速發(fā)展，其特點(diǎn)是操作簡單、安全（不使用同位素）、計(jì)算機(jī)精確控制、快速等。DNA自動(dòng)測序技術(shù)的基本原理是利用了Sanger雙脫氧核苷酸末端終止法，在反應(yīng)過程中，標(biāo)記有熒光素（fluorescein）引物在DNA聚合酶作用下，按照堿基配對的原則，分別將4種dNTP（熒光素標(biāo)記）底物加到引物的3'－OH端，與dNTP的5'－磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵連接；如果反應(yīng)體系中含有2'3'雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP），雖然可摻入到正在延伸的DNA鏈中，但是由于沒有3'－OH，不能與后面的dNTP形成磷酸二酯鍵，使合成反應(yīng)終止，得到一系列長度不同的以ddNTP結(jié)尾的一組片段，電泳之后可以直接讀出堿基順序。如Pharmacia公司的ALF全自動(dòng)激光熒光DNA測序系統(tǒng)，PE公司的ABI377型DNA自動(dòng)測序儀可自動(dòng)進(jìn)行順序分析、電泳、檢測條帶及堿基分析，需要工作人員操作的只是和進(jìn)行反應(yīng)及制膠。ABI最新型的全自動(dòng)測序儀PRISM310型采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代了傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠平板電泳，不僅具有DNA測序、PCR片段大小分子和定量分析功能，且實(shí)現(xiàn)了全部操作自動(dòng)化，包括灌膠、進(jìn)樣、電泳、檢測、數(shù)據(jù)分析等。13．基因芯片系統(tǒng)：Affymetrix公司的基因芯片為寡核苷酸芯片（Oligo芯片），這種類型的芯片具有極高的特異性和靈敏度，重復(fù)性好，假陽性率非常低，是目前世界上最先進(jìn)的基因芯片。Affymetrix所利用的原位光刻專利技術(shù)可使一張芯片上合成多達(dá)500,000個(gè)寡核苷酸。該系統(tǒng)可以分析樣品中DNA或者RNA序列的相對含量。可廣泛應(yīng)用于從人類疾病的分子機(jī)理到臨床診斷、免疫學(xué)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、細(xì)胞周期與凋亡、藥物代謝與毒理、神經(jīng)發(fā)育與老化、肥胖與糖尿病、抗真菌藥物篩選、細(xì)菌基因組以及植物基因調(diào)控等研究領(lǐng)域。14．顯微操作系統(tǒng)：顯微操作系統(tǒng)是進(jìn)行基因顯微注射，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)基因必不可缺少的儀器之一。四、其它常規(guī)儀器及設(shè)備1．冰箱：常用的有4℃、―20℃和―802．天平：可備有多種規(guī)格和靈敏度的架盤天平和電子天平，以滿足不同實(shí)驗(yàn)要求。3．酸度計(jì)：大部分試劑要求嚴(yán)格的pH值，因此應(yīng)具有一臺(tái)精確度較高的酸度計(jì)；而pH試紙只適用于培養(yǎng)基、緩沖液等要求不高的溶液pH值的粗略估計(jì)。注意，許多緩沖液的pH值與溫度有密切關(guān)系，如50mmol/L的Tris·Cl溶液，在4℃時(shí)的pH值為8.6，25℃時(shí)為8.0，37℃4．磁力攪拌器：用于混勻樣品，常配備加熱功能。5．可調(diào)微量加液器：具有不同量程，用于各種微量液體體積的吸取。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有一套不同規(guī)格的加液器，如Gilson產(chǎn)品的0～10μL、0～100μL、0～200μLl、0～1000μL和0～5000μL等加液器。6．電熱烘箱：用于干燥實(shí)驗(yàn)器皿等。一般玻璃器皿在高溫下干燥，如RNA研究使用的器皿需在200℃烘干2h，以去除RNase的污染；而塑料器皿一般在較低溫度下（42～457．恒溫水浴鍋：溫度一般從室溫至100℃8．循環(huán)式水槽：可以制冷。主要用于某些酶反應(yīng)、電泳冷卻循環(huán)用水等。9．純化水裝置許多實(shí)驗(yàn)要求較高純度的水，常使用的有雙蒸水，其中的大部分有機(jī)雜質(zhì)被除去，但無機(jī)離子仍存在，且制作時(shí)間較長；去離子水，通過離子交換樹脂進(jìn)行處理。有些實(shí)驗(yàn)還要求使用超純水，美國的微孔濾膜公司（MilliporeCorporation）的Milli-Q系統(tǒng)制造的超純水，采用紫外燈后凈化柱，可除去無機(jī)粒子和有機(jī)物，并經(jīng)過0.22μm孔徑的終端過濾器，可完全除去該孔徑以上的微生物及粒子。10．制冰機(jī)：用于提供實(shí)驗(yàn)操作所需要的低溫環(huán)境。11．微波爐：可方便地進(jìn)行溶液的快速加熱，如瓊脂糖凝膠的溶化、雜交洗膜液的定點(diǎn)加溫等。12．液氮罐：液氮溫度為－196℃，主要用于冷凍貯存細(xì)胞、細(xì)胞株、菌株、動(dòng)植物樣品等，以較好地保持細(xì)胞生物學(xué)特性?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)室需要，準(zhǔn)備不同容量（10L、35L和50L13．高壓滅菌鍋：在進(jìn)行細(xì)胞和細(xì)菌培養(yǎng)等無菌操作時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)用品、試劑及培養(yǎng)基等都需要高壓蒸汽滅菌；另外在進(jìn)行核酸制備和酶解等有關(guān)操作時(shí)，要求沒有核酸酶的存在，所以實(shí)驗(yàn)使用的所有用具和試劑等也要滅菌。一般在15lbf/in2（1.034×105Pa）壓力下，滅菌20min即可。注意有些試劑不能耐受高溫高壓處理，可用濾膜除菌；器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。14．快速振蕩混勻器：用于組織或細(xì)胞樣品的混勻等。15．組織勻漿器：用于組織或細(xì)胞樣品的破碎、分離和提純等。16．超聲破碎儀：用于組織或細(xì)胞樣品的破碎、分離和提純等。17．超聲清洗器：超聲清洗主要是利用超聲波在液體中的空化作用，這種空化作用是由于在超聲波作用下，液體分子時(shí)而受拉，時(shí)而受壓，形成一個(gè)個(gè)微小的空腔，即所謂”空化泡”,由于空化泡的內(nèi)外壓力相差懸殊，所以在其消失時(shí)具有很大的沖擊力，使粘附在物質(zhì)表面的污物脫落。同時(shí)超聲波在液體中又能加速溶解和乳化作用，從而達(dá)到清洗的目的。18．真空泵：為樣品提取和純化等設(shè)備提供穩(wěn)定的負(fù)壓。19．冷凍干燥儀：用于生物樣品的冷凍干燥。五、放射性核素操作在基因工程實(shí)驗(yàn)中，有些實(shí)驗(yàn)如DNA序列測定、核酸探針的體外標(biāo)記和分子雜交等，需要使用放射性核素。由于它具有放射性，對人體產(chǎn)生輻射損傷并污染環(huán)境，所以操作必須在專用的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并具備防護(hù)措施，如使用鉛玻璃或有機(jī)玻璃屏蔽、戴上有機(jī)玻璃眼鏡、戴乳膠手套操作、使用長柄工具（以加大操作者與放射源之間的距離）操作等。在基因工程實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用的放射性核素有32P、33P、35S和3H等，它們都是進(jìn)行β衰變的，除了32P之外，其余幾種核素能量很低。特別注意，放射性廢物（包括廢液、吸頭、濾紙、玻璃器皿和實(shí)驗(yàn)材料等）要單獨(dú)收集，分類存放于指定地點(diǎn)，并標(biāo)明核素類別、放射性活度、日期和數(shù)量等，排放時(shí)必須遵守國家有關(guān)規(guī)定。放射性同位素實(shí)驗(yàn)室除了一些專用于測定放射性活度的儀器外，還需要一些常規(guī)儀器，如冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、恒溫?fù)u床、雜交箱和紫外交聯(lián)儀等等，注意，原則上放射性同位素實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器與其它實(shí)驗(yàn)室的儀器是不共用的。1．液體閃爍計(jì)數(shù)器：閃爍測量技術(shù)是利用某種閃爍物質(zhì)將輻射能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽埽倮霉怆姳对龉苁怪D(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖，從而分析射線的數(shù)量和能量。根據(jù)閃爍劑的物理狀態(tài)，可分為固體閃爍測量技術(shù)和液體閃爍測量技術(shù)。液體閃爍計(jì)數(shù)器使用的閃爍體為液體，是由有機(jī)閃爍體溶于適當(dāng)溶劑中組成，放射性樣品置于液體閃爍體中，使射線直接被吸收，提高了探測效率。所以這種技術(shù)不僅測量的放射性核素和射線類型廣，而且最適合于測量穿透力較弱的射線，特別是低能β射線如3H，因?yàn)槟芰康?，其它儀器難以測量。目前液體閃爍測量技術(shù)在生命科學(xué)中廣泛應(yīng)用于生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能研究、物質(zhì)的吸收與分布等代謝研究、分子雜交分析和放射免疫分析