凝膠電泳及分配層析

關(guān)于凝膠電泳及分配層析第1頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三一概念

分配層析是利用各組分在兩相中分配系數(shù)的不同，而使各組分分離的層析方法。二原理

由于不同溶質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速率不同因此可以達到分離的效果。分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時受溫度、壓力等條件的影響，所以不同的物質(zhì)在不同的條件下，其分配系數(shù)各不相同。在層析條件確定后，某溶質(zhì)在確定的層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一常數(shù)。分配系數(shù)

分配色譜的狹義分配系數(shù)表達式如下：K=Cs╱Cm=（Xs/Vs）╱（Xm/Vm）式中Cs代表組分分子在固定相液體中的溶解度，Cm代表組分分子在流動相中的溶解度。第2頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三三過程在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸附一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上；另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相向流動，稱為流動相。當某溶質(zhì)在流動相的帶動下流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。第3頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三四應(yīng)用分配層析包括紙層析、薄層層析和分配氣相層析等方法。一紙層析

在紙層析中的流動相是指層析液，在毛細拉力作用下，層析液能不斷由下向上流動。固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具親水性使這部分水束縛在纖維素周圍，不易擴散而成為固定相。在層析過程中，當層析液在毛細拉力作用下，上升流經(jīng)色素濾液細線時，濾液細線上的色素就相繼融入層析液，隨著層析液上升，并發(fā)生在分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)的不同，那些分配系數(shù)大的色素分子，隨層析液向上移動得快，形成的色素帶集中在濾紙的上部；而分配系數(shù)小的色素分子，隨層析向上移動得慢，形成的色素帶集中在濾紙的下面。

第4頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三

紙層析設(shè)備簡單，操作簡便，所需樣品少，分辨能力一般能達到要求，在實驗室用于各種組分的分離并進行定性定量分析。但是其展開時間長，分離量小，不適用于大量組分的工業(yè)劃分離生產(chǎn)，而且作為流動相的有機溶劑可能引起酶的變性失活。二薄層層析

薄層層析是將作為固定相支持物均勻的鋪在支持板（一般用玻璃板）上，成為薄層。把樣品點到薄層上，用適宜的溶劑展開，利用各種組分的移動距離不同，而使各組分分離。如果支持物是固定吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，層析時是依據(jù)吸附力的不同使組分分離，則稱吸附薄層層析；如果支持物是纖維素、硅藻土等，層析時主要依據(jù)分配系數(shù)的不同而使組分分離，則稱分配薄層層析。薄層層析的展開時間段，分辨率比紙層析高10~100倍，既可作分析用分離0.01ug的微量樣品又能做制備用分離500mg甚至更多的樣品，因此薄層可以規(guī)格化制備。然而薄層層析的重現(xiàn)性比紙層析差，對酶等生物大分子的分離效果不理想。第5頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三凝膠電泳概念凝膠電泳（Gelelectrophoresis）

是以凝膠為載體，以電流為驅(qū)動，用于分離不同大小、形狀、等電點等分子的技術(shù)。凝膠電泳通常用于分析用途。但也可以作為制備技術(shù)，如在使用質(zhì)譜(MS)、PCR、克隆、DNA測序、免疫印跡等檢測之前用于提純分子。

基本原理及過程

第6頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三瓊脂糖凝膠電泳原理：

瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D－半乳糖和3,6脫水L－半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1％－3％，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻澹⑷肽０搴笫覝叵吕鋮s凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。

瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1％的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質(zhì)來說是比較大的，對蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時蛋白質(zhì)分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來進行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，第7頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三這時分子的大小會對電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。例如對于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)，而與堿基排列及組成無關(guān)。另外，一些低熔點的瓊脂糖（62C時熔化，因此其中的樣品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。

由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應(yīng)用得相對較少。

目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下：

1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。

2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。

3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。

4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。

第8頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三操作流程準備干凈的配膠板和電泳槽

注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。選擇電泳方法一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。

正確選擇凝膠濃度對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。

適合的電泳緩沖液

第9頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

電泳的合適電壓和溫度電泳時電壓不應(yīng)該超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象

DNA樣品的純度和狀態(tài)是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象DNA樣品的純度和狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。第10頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量標準每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。Marker的選擇DNA電泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。TIANGEN公司的DNAMarker條帶清晰，亮度均勻，質(zhì)量穩(wěn)定，是您實驗的首選。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。第11頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三凝膠的染色和觀察實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBRGreen，GelRed，雖然毒性小，但價格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統(tǒng)EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。從瓊脂糖中回收DNA片段電泳洗脫法低熔點瓊脂糖凝膠電泳挖塊法凍融回收法玻璃奶回收法柱回收法

膠回收注意事項：將電泳槽用ddH2O反復(fù)清洗干凈，倒入新鮮配制的滅菌電泳緩沖液；根據(jù)點樣量制備合適厚度的瓊脂糖凝膠板；切膠時盡可能切掉不含DNA片段的凝膠；要盡量減少DNA在紫外下的照射時間以減少對DNA的損傷；熔膠要完全。第12頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學聚合和光聚合?；瘜W聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基。溶液的pH對聚合作用是重要的，因為過低pH沒有足夠的堿基加速催化反應(yīng)，同樣過多的氧分子存在，會使聚合作用很快停止。所以制備凝膠時，在加過硫酸銨之前，混合物必須抽去空氣。核黃素催化的聚合作用，常用于制備濃縮膠，因為這樣制得的凝膠孔度要大些。核黃素在光照射下及有微量氧存在時，產(chǎn)生自由基使Acr發(fā)生聚合作用。第13頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三操作流程1.配制SDS聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑2．SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制3．用考馬斯亮藍對SDS聚丙烯酰胺凝膠進行染色經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍R250染色。染色1～2小時或過夜。4.換脫色液脫色，需3～10小時，其間更換多次脫色液至背景清楚。注意事項制備膠所使用的玻璃板或玻璃管均需要潔凈并經(jīng)過干燥方能使用制備膠時，小心避免混入氣泡，為此再將各種所需比例的貯存混合后，應(yīng)進行抽氣處理。第14頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三應(yīng)用

凝膠電泳被廣泛用于分子生物學、遺傳學和生物化學：1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophor