第二章-微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶本章主要內(nèi)容：酶的生產(chǎn)方法；酶生物合成的基本理論；發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及控制；難點(diǎn)：酶生物合成的誘導(dǎo)和阻遏；發(fā)酵過(guò)程細(xì)胞生長(zhǎng)與酶合成之間的關(guān)系。重點(diǎn)：酶生物合成的模式；

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶工藝。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

目前工業(yè)用酶大多數(shù)來(lái)自微生物。經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作，利用微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)獲得所需酶的技術(shù)過(guò)程稱(chēng)為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。

酶的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)在酶生產(chǎn)的主要方法。

酶發(fā)酵生產(chǎn)的前提之一：選育到性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物！對(duì)產(chǎn)酶微生物的要求：

（1）產(chǎn)酶量高；（2）易培養(yǎng)和管理；（3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定；（4）利于酶產(chǎn)品的分離純化；（5）安全可靠、無(wú)毒性等。

酶發(fā)酵生產(chǎn)的類(lèi)型1、固體培養(yǎng)發(fā)酵：主要適于各種霉菌的發(fā)酵產(chǎn)酶

培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料，經(jīng)滅菌后，接入產(chǎn)酶菌株，在一定條件下發(fā)酵。麩皮、米糠酒曲、醬油曲淀粉酶、蛋白酶優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，酶濃度高。缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，原料利用率低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。2、液體深層發(fā)酵（目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式）

液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后，接入產(chǎn)酶細(xì)胞，在一定條件下發(fā)酵。適于微生物、動(dòng)植物細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：機(jī)械化強(qiáng)度高，酶產(chǎn)率高，產(chǎn)品回收率高缺點(diǎn)：技術(shù)管理要求高3、固定化細(xì)胞發(fā)酵（70年代后期發(fā)展）

將細(xì)胞固定在載體上后，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞密度高，可反復(fù)使用，利于產(chǎn)品分離純化缺點(diǎn)：需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器，只適用胞外酶生產(chǎn)4、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵（80年代中期發(fā)展）

原生質(zhì)體是指除去了細(xì)胞壁的微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：解除細(xì)胞壁擴(kuò)散阻礙；易于細(xì)胞間質(zhì)中的酶的分泌；可反復(fù)或連續(xù)使用缺點(diǎn)：制備復(fù)雜，維持較高的滲透壓，需防止細(xì)胞壁再生第一節(jié)微生物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)一、酶生物合成的基本過(guò)程DNARNA蛋白質(zhì)（新生多肽鏈）成熟蛋白質(zhì)（酶）胞內(nèi)胞外轉(zhuǎn)錄翻譯加工分泌或定位二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：通過(guò)調(diào)節(jié)酶合成的量來(lái)控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，主要是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。意義：通過(guò)阻止酶的過(guò)量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。

按酶生物合成的速度，把細(xì)胞中合成的酶分為兩類(lèi)：組成酶—恒定（速度、濃度）誘導(dǎo)酶—在外界環(huán)境因素誘導(dǎo)下合成速度急增，酶濃度成百上千倍增加(適應(yīng)型酶、調(diào)節(jié)型酶)1960，Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說(shuō)闡明；與生物合成相關(guān)的四個(gè)基因：調(diào)節(jié)基因Regulatorgene；啟動(dòng)基因Promotergene；操縱基因Operatorgene；結(jié)構(gòu)基因Structuralgene；

調(diào)節(jié)基因(R)：

可產(chǎn)生一種變構(gòu)蛋白，通過(guò)與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。啟動(dòng)基因（P）（啟動(dòng)子）：

有兩個(gè)位點(diǎn)：（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。CAP：分解代謝物活化劑蛋白，又稱(chēng)環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。

操縱基因（Operatergene）:

位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。酶合成的基因調(diào)控類(lèi)型：誘導(dǎo)和阻遏1、酶合成的誘導(dǎo)作用

加進(jìn)某些物質(zhì)，使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象，稱(chēng)為誘導(dǎo)作用。誘導(dǎo)物一般是酶催化作用的底物或其底物類(lèi)似物。

例：乳糖誘導(dǎo)?-半乳糖苷酶的合成淀粉誘導(dǎo)a-淀粉酶的合成2、酶合成的阻遏（1）終產(chǎn)物阻遏

指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。（2）分解代謝物阻遏

是指某些物質(zhì)經(jīng)過(guò)分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏其他酶合成的現(xiàn)象。

葡萄糖阻遏?-半乳糖苷酶的生物合成果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成A1B1A2B2E×A→→→→→BE×色氨酸過(guò)量時(shí)會(huì)阻遏催化色氨酸合成的相關(guān)酶三、酶生物合成的模式微生物細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)過(guò)程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、平衡期和衰退期等4個(gè)階段調(diào)整期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平衡期衰亡期時(shí)間細(xì)胞數(shù)量的對(duì)數(shù)（一）微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)（Microbialgrowthcurve）（二）酶生物合成的模式

（1）同步合成型（2）延續(xù)合成型（3）中期合成型（4）滯后合成型

通過(guò)分析比較細(xì)胞生長(zhǎng)與酶產(chǎn)生的關(guān)系,可以把酶的生物合成的模式分為4種類(lèi)型：1、同步合成型酶的生物合成與細(xì)胞的生長(zhǎng)同步進(jìn)行，又稱(chēng)生長(zhǎng)偶聯(lián)型。大部分組成酶和部分誘導(dǎo)酶的生物合成屬于同步合成型。特點(diǎn)：（1）發(fā)酵開(kāi)始，細(xì)胞生長(zhǎng)，酶也開(kāi)始合成，說(shuō)明不受分解代謝物和終產(chǎn)物阻遏。（2）生長(zhǎng)至平衡期后，酶濃度不再增長(zhǎng)，說(shuō)明mRNA很不穩(wěn)定。時(shí)間(h)濃度細(xì)胞濃度酶濃度2、中期合成型酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶的合成也停止。特點(diǎn)：（1）該類(lèi)酶的合成受分解代謝物阻遏。（2）該酶對(duì)應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定。濃度酶濃度細(xì)胞濃度時(shí)間(h)3、延續(xù)合成型酶的合成伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而開(kāi)始，但在細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)的一段時(shí)間。特點(diǎn)：（1）該類(lèi)酶不受分解代謝產(chǎn)物阻遏和終產(chǎn)物阻遏。（2）該酶對(duì)應(yīng)的mRNA是相當(dāng)穩(wěn)定的。時(shí)間(h)濃度細(xì)胞濃度酶濃度4、滯后合成型只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后，酶才開(kāi)始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類(lèi)型。特點(diǎn)：（1）該類(lèi)酶受分解代謝物阻遏作用的影響，阻遏解除后，酶才大量合成。（2）該酶對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。時(shí)間(h)濃度酶濃度細(xì)胞濃度

屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間甚至進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開(kāi)始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類(lèi)型酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后的相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。同步合成型中間合成型延續(xù)合成型滯后合成型酶合成起始時(shí)間酶合成停止時(shí)間產(chǎn)酶與生長(zhǎng)相關(guān)特點(diǎn)生長(zhǎng)與酶合成偶聯(lián)度酶mRNA穩(wěn)定性酶生物合成與生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)式比較生長(zhǎng)開(kāi)始對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)開(kāi)始平衡期衰亡期平衡期后平衡期平衡期同起同停晚起晚停同起晚停晚起同停非偶聯(lián)過(guò)渡偶聯(lián)緊密偶聯(lián)很穩(wěn)定較穩(wěn)定不穩(wěn)定不穩(wěn)定小結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素：培養(yǎng)基中阻遏物的存在和mRNA的穩(wěn)定性。（1）不受培養(yǎng)基中某種物質(zhì)阻遏時(shí)，可隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而開(kāi)始合成；受阻遏的酶，要在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或進(jìn)入平衡期后，解除阻遏，酶才開(kāi)始合成。（2）mRNA穩(wěn)定性高的，可在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼續(xù)合成其對(duì)應(yīng)的酶；穩(wěn)定性差的，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)停止而終止酶的合成。

選擇：在酶的工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高酶產(chǎn)率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式是延續(xù)合成型。

改造非理想模式：在細(xì)胞選育上下功夫，并適當(dāng)調(diào)節(jié)工藝條件：（1）同步合成型：適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提高酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性。（2）中期合成型：要從解除阻遏和提高mRNA的穩(wěn)定性?xún)煞矫孢M(jìn)行努力。（3）滯后合成型在發(fā)酵過(guò)程中要盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開(kāi)始。選擇與改造第二節(jié)產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的微生物必需具備的條件：（1）酶的產(chǎn)量高（2）容易培養(yǎng)和管理（3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好（4）利于酶的分離純化（5）安全可靠新開(kāi)發(fā)的酶必須按規(guī)定進(jìn)行下表的各項(xiàng)檢查項(xiàng)目試驗(yàn)動(dòng)物急性中毒鼠,大白鼠口服4周大白鼠12月狗致癌試驗(yàn):24月兩重嚙齒動(dòng)物畸胚組織發(fā)生試驗(yàn)(24月)兩重嚙齒動(dòng)物生產(chǎn)病原性試驗(yàn)四種動(dòng)物皮膚刺激性試驗(yàn)(膚,眼)兔子,人抗原性人（一）常用的產(chǎn)酶微生物1、細(xì)菌大腸桿菌（Escherichiacoli）形態(tài)：桿狀，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢，一般無(wú)莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。

大多數(shù)大腸桿菌是無(wú)害，但也有些大腸桿菌是致病的，會(huì)引起腹瀉和尿路感染。易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長(zhǎng)迅速，而且營(yíng)養(yǎng)要求低。應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌，一般分泌胞內(nèi)酶。常在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、限制性核酸內(nèi)切酶等。醋酸桿菌（Acetobacter）

菌體從橢圓至桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈，革蘭氏陰性，不生芽孢。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。應(yīng)用：有機(jī)酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)莢膜。枯草芽孢桿菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶。2、放線(xiàn)菌(Actinomycetes)放線(xiàn)菌是一類(lèi)具有分支狀菌絲的單細(xì)胞原核微生物,由于菌落呈放射狀而得。

放線(xiàn)菌是一類(lèi)介于細(xì)菌和真菌之間的單細(xì)胞生物。一方面,放線(xiàn)菌的細(xì)胞構(gòu)造和細(xì)胞壁的化學(xué)組成與細(xì)菌相似,與細(xì)菌同屬原核生物;另一方面,放線(xiàn)菌菌體呈纖細(xì)的菌絲狀,而且分支,又以外生孢子的形式繁殖,這些特征又與霉菌相似。放線(xiàn)菌菌落中的菌絲常從一個(gè)中心向四周輻射狀生長(zhǎng),因此叫放線(xiàn)菌。放線(xiàn)菌產(chǎn)酶舉例鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素酰化酶、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。3、霉菌（molds）霉菌:是一類(lèi)絲狀真菌。構(gòu)成霉菌菌（個(gè)）體的基本單位稱(chēng)為菌絲（hyphae），呈長(zhǎng)管狀，可不斷自前端生長(zhǎng)并分支。在固體基質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)，部分菌絲深入基質(zhì)吸收養(yǎng)料，稱(chēng)為基質(zhì)菌絲或營(yíng)養(yǎng)菌絲；向空中伸展的稱(chēng)氣生菌絲，可進(jìn)一步發(fā)育為繁殖菌絲，產(chǎn)生孢子。大量菌絲交織成絨毛狀、絮狀或網(wǎng)狀等，稱(chēng)為菌絲體（mycelium）。菌絲體常呈白色、褐色、灰色，或呈鮮艷的顏色，有的可產(chǎn)生色素使基質(zhì)著色（如赤霉菌等）。霉菌繁殖迅速，常造成食品、用具大量霉腐變質(zhì)，但許多有益種類(lèi)已被廣泛應(yīng)用，是人類(lèi)實(shí)踐活動(dòng)中最早利用和認(rèn)識(shí)的一類(lèi)微生物。霉菌與產(chǎn)酶選用不同的霉菌作為發(fā)酵菌種，不僅可以釀制醬、醬油、醋、豆腐乳等食品，還可以應(yīng)用于生產(chǎn)有機(jī)酸、酶制劑、維生素、生物堿及激素等多種產(chǎn)品;據(jù)統(tǒng)計(jì)，在550種酶制劑中有近1/3是霉菌產(chǎn)生的。霉菌產(chǎn)酶舉例

黑曲霉（Aspergillusniger）生產(chǎn)糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、過(guò)氧化氫酶、脂肪酶等；米曲霉（Aspergillusoryzae）生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果膠酶等。紅曲霉（Monascus）生產(chǎn)α-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶等。青霉（Penicillium）青霉是世界分布最廣的幾類(lèi)真菌之一。生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素?；?、纖維素酶等。(一)生活習(xí)性

青霉通常在柑桔及其他水果上,冷藏的干酪及被它們的孢子污染的其他食物上均可找到,其分生孢子在土壤內(nèi),空氣中及腐爛的物質(zhì)上到處存在，青霉?fàn)I腐生生活。(二)形態(tài)

青霉的營(yíng)養(yǎng)體為無(wú)色或淡色的菌絲體,菌絲各細(xì)胞之間有橫隔膜。整個(gè)菌絲體分為伸入營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中吸取營(yíng)養(yǎng)的基質(zhì)菌絲和伸向空氣中的氣生菌絲。在氣生菌絲上產(chǎn)生簡(jiǎn)單的長(zhǎng)而直立的分生孢子梗,分生孢子為球形至卵形,呈綠色,藍(lán)色或黃色,即通?？吹降母鞣N青霉菌落特有的顏色。木霉（Trichoderma）木霉具有較強(qiáng)分解纖維素能力。在木質(zhì)素、纖維素豐富的基質(zhì)上生長(zhǎng)快，傳播蔓延迅速。棉籽殼、木屑、段木都是其良好的營(yíng)養(yǎng)物。生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。根霉(Rhizopus)根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營(yíng)養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見(jiàn)于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。應(yīng)用：根霉能產(chǎn)生糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶等。4、酵母

啤酒酵母：丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等。

假絲酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等。（二）生產(chǎn)菌種的來(lái)源1、向菌種中心購(gòu)買(mǎi)或索取。

中國(guó)國(guó)家級(jí)菌種保藏管理中心（7個(gè)）

名稱(chēng)依托單位中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所(ACCC)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院(CICC)中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)藥品生物制品檢定所(CMCC)中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)獸醫(yī)藥品檢定所(CVCC)中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院(CFCC)中國(guó)抗菌素菌種保藏管理中心中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所(CACC)中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心中國(guó)科學(xué)院微生物研究所(CCGMC)

國(guó)外菌種中心AmericanTypeCultureCollection

JapanCollectionofMicroorganisms

TheUnitedKingdomNationalCulturecollection

DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen

ATCC美國(guó)菌種中心，最大的菌種中心,有病毒、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞等不同的微生物

JCM日本微生物菌種中心英國(guó)國(guó)家菌種中心，Over70,000micro-organismsandcelllinesareavailable.

德國(guó)微生物與細(xì)胞收集中心（1）樣品的采集（采樣）：主要是各種富含所需微生物的土壤、水、氣、枯枝爛葉、爛水果等；產(chǎn)酶菌種篩選步驟：2、篩選

由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中進(jìn)行分離篩選。（2）初篩：分離產(chǎn)目的酶的菌株；

給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株分離出來(lái)。產(chǎn)-淀粉酶菌株的篩選產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選（3）復(fù)篩：從所得菌株中篩選優(yōu)良株；在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。（三）產(chǎn)酶菌種的保存

保藏方法:斜面保藏法、沙土保藏法、真空冷凍干燥保藏法、低溫保藏法、石蠟油保藏法等。第三節(jié)發(fā)酵產(chǎn)酶工藝條件及其控制

發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑，就是給酶的生產(chǎn)菌種提供適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)環(huán)境，使生產(chǎn)菌大量增殖，同時(shí)合成所需要的酶，然后由發(fā)酵所得物料制成酶產(chǎn)品。

現(xiàn)代酶制劑的大規(guī)模生產(chǎn)以液體深層發(fā)酵法為主。

無(wú)論哪種發(fā)酵法，都要做三方面的工作：（1）從原料準(zhǔn)備培養(yǎng)基；（2）從原始菌種準(zhǔn)備生產(chǎn)菌種；（3）發(fā)酵過(guò)程管理。發(fā)酵產(chǎn)酶的一般工藝流程[原料][原始菌種][麩皮等原料]

↓↓餅粕等原料淀粉質(zhì)原料試管斜面培養(yǎng)(活化)[配制培養(yǎng)基]

↓

↓

↓(滅菌)按不同原料凈化、粉碎搖瓶等分級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)作不同處理↓

↓水解種子罐培養(yǎng)

↓

↓

[淀粉糖液][發(fā)酵罐(液體發(fā)酵)][發(fā)酵池(固體發(fā)酵)]

↓↓

↓

培養(yǎng)

配制培養(yǎng)基↓

(滅菌)[發(fā)酵液][成品曲]

↓↓

↓下游加工

{液態(tài)酶制劑}

↓{固體粗酶制劑}{各種精制酶制劑}酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程圖

一、生產(chǎn)種子的制備

生產(chǎn)種子：由原始保藏菌種，經(jīng)過(guò)活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，用于發(fā)酵罐接種的大量菌體。1、種子制備工藝過(guò)程保藏菌種活化培養(yǎng)逐級(jí)搖瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)接種至發(fā)酵罐（1）菌種活化

目的：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動(dòng)能力。

方法：在試管斜面上培養(yǎng)1-3代。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)

目的：活化后的菌種經(jīng)過(guò)一級(jí)至數(shù)級(jí)的擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)基稱(chēng)為種子培養(yǎng)基。

方法：分為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和車(chē)間培養(yǎng)兩個(gè)階段。擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)注意的事項(xiàng)：（1）盡量減少傳代次數(shù)，以降低菌種衰退和污染的可能性；（2）培養(yǎng)基成分一般應(yīng)比發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豐富；（3）培養(yǎng)時(shí)間一般控制在微生物生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，及時(shí)接入下一級(jí)培養(yǎng)或發(fā)酵罐；（4）嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（pH、溫度、通氣量等），加強(qiáng)培養(yǎng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。二、培養(yǎng)基1、碳源：提供碳元素；能源。

碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素、水等。

來(lái)源：淀粉及其水解物—淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯類(lèi)、玉米、麩皮、米糠等。此外有些微生物可以采用脂肪、石油、乙醇等為碳源。

注意：在選擇碳源時(shí)，應(yīng)盡量選擇對(duì)所需酶有誘導(dǎo)作用的碳源，而不使用或少使用有分解代謝物阻遏作用的碳源。

培養(yǎng)基是人工配制的供微生物生長(zhǎng)、繁殖及合成酶的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。2、氮源：提供氮元素。

來(lái)源：①有機(jī)氮：常利用農(nóng)副產(chǎn)品的籽實(shí)榨油后的副產(chǎn)品，如豆餅、花生餅、菜子餅等；②無(wú)機(jī)氮：含氮的無(wú)機(jī)化合物，如（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3和（NH4）3PO4等。3、無(wú)機(jī)鹽：大量元素和微量元素。基本功能：構(gòu)成細(xì)胞的成分；構(gòu)成酶產(chǎn)品的組分；作為酶的激活劑。4、生長(zhǎng)因子

指微生物生長(zhǎng)繁殖所必不可缺的微量有機(jī)物，主要包括各種氨基酸、嘌呤或嘧啶、維生素等三類(lèi)物質(zhì)。

酶制劑中所用的生長(zhǎng)因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、麩皮、米糠、酵母膏等。5、水配制培養(yǎng)基的注意事項(xiàng)：（1）培養(yǎng)基的碳氮比是培養(yǎng)基成分配比的重點(diǎn)；（2）碳源和氮源的選擇，要注意避免碳分解代謝阻遏和氮分解代謝阻遏；（3）培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的選擇要注意鹽類(lèi)引起的生理酸堿性反應(yīng)；（4）發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基成分配比不可輕易改變。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基舉例1、枯草桿菌BF7658ａ-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8%

豆餅粉4%

磷酸氫二鈉0.8%

硫酸銨0.4%

氯化鈣0.2%

氯化銨0.15%

自然pH2、黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉10%

豆餅4%

麩皮1%pH4.4~5.0（二）培養(yǎng)基的種類(lèi)1、斜面培養(yǎng)基：是供菌種生長(zhǎng)繁殖使用的。2、種子培養(yǎng)基：是供菌種生長(zhǎng)繁殖使用的。3、發(fā)酵培養(yǎng)：是供菌種生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物合成之用。三、發(fā)酵條件的控制1、溫度的調(diào)節(jié)控制（2）有些微生物生長(zhǎng)最適溫度與發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度有所不同。例：醬油曲霉生產(chǎn)蛋白酶，28℃時(shí)蛋白酶產(chǎn)量比在40℃條件下高2~4倍，在20℃條件下發(fā)酵，則蛋白酶產(chǎn)量更高，但細(xì)胞生長(zhǎng)速率較慢。

為此，在有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，要在不同的發(fā)酵階段控制不同的溫度，即在微生物生長(zhǎng)階段控制在生長(zhǎng)的最適溫度范圍，而在產(chǎn)酶階段控制在產(chǎn)酶最適溫度范圍。（1）不同的微生物有不同的最適生長(zhǎng)溫度。（3）溫度的控制方法

一般采用熱水升溫，冷水降溫。因此，在發(fā)酵罐中均設(shè)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管，夾套、噴淋管等。2、pH值的調(diào)節(jié)控制（1）不同微生物，其生長(zhǎng)繁殖的最適pH值有所不同。（2）微生物生長(zhǎng)的最適pH值與產(chǎn)酶最適pH值往往不同。（3）有些微生物可以同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)控制培養(yǎng)基的pH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。黑曲霉α-淀粉酶糖化酶pH值中性↑↓pH值偏酸性↓

↑

（4）影響pH值的因素一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基成分中C/N比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N比低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。不同鹽的利用對(duì)pH也會(huì)產(chǎn)生影響。（5）生產(chǎn)中控制pH值的方法②添加緩沖液維持一定的pH值（如磷酸鹽）；①調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始pH，保持一定的C/N比；③發(fā)酵液中pH過(guò)高，加糖或淀粉來(lái)調(diào)節(jié)。反之，加尿素或液氨；pH值還與通氣量有關(guān)。④通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量來(lái)實(shí)現(xiàn)；加酸、堿。3、溶解氧的調(diào)節(jié)控制

溶解氧指溶解在培養(yǎng)基中的氧。微生物一般只能利用溶解氧。調(diào)節(jié)溶氧速率的方法（1）調(diào)節(jié)通氣量；（2）調(diào)節(jié)氧的分壓；（3）調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間；（4）調(diào)節(jié)氣液接觸面積；（5）改變培養(yǎng)液性質(zhì)。5、濕度的調(diào)節(jié)控制

用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時(shí)，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。4、泡沫形成：通氣攪拌、培養(yǎng)基中某些成分的變化、代謝產(chǎn)生的氣體。危害：阻礙CO2的排除，影響氧的溶解；引起染菌。消泡方法：機(jī)械消泡、化學(xué)消泡。四、提高酶產(chǎn)量的措施（一）添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，添加酶合成的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶產(chǎn)量。1、不同的酶有各自不同的誘導(dǎo)物；但有時(shí)一種誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)生成同一酶系的若干種酶；同一種酶往往有多種誘導(dǎo)物。3、誘導(dǎo)物的濃度：必須控制在適當(dāng)濃度。2、誘導(dǎo)物的分類(lèi)

（1）酶作用的底物；（2）酶作用底物的類(lèi)似物；（3）酶的反應(yīng)產(chǎn)物；（4）底物和底物類(lèi)似物的前體物。（二）控制阻遏物的濃度1、解除終產(chǎn)物阻遏的方法降低培養(yǎng)基中酶作用產(chǎn)物的濃度；添加終產(chǎn)物的類(lèi)似物。2、解除分解代謝產(chǎn)物阻遏的方法控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源濃度，可采用其他較難利用的碳源（如淀粉等），或采用補(bǔ)料，分次流加碳源等方法，以控制碳源濃度在較低的水平，以利于酶產(chǎn)量的提高；添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP），可以解除分解代謝物阻遏作用。（三）通過(guò)基因突變提高酶產(chǎn)量使誘導(dǎo)型變成組成型；使阻遏型變成去阻遏型。（四）其他提高酶產(chǎn)量的方法1、添加細(xì)胞滲漏增強(qiáng)物：

如吐溫（Tween）、催通（Triton）等。

在培養(yǎng)基中添加