實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取

實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈮A法提取質(zhì)粒的原理；掌握堿法提取質(zhì)粒的方法；掌握DNA瓊脂糖電泳的原理和方法。當(dāng)前1頁(yè)，總共25頁(yè)。實(shí)驗(yàn)原理

質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外的、具有自主復(fù)制能力的、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小型DNA分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是實(shí)驗(yàn)室常用的方法。這種方法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。當(dāng)前2頁(yè)，總共25頁(yè)。結(jié)構(gòu)的三大要素：

多克隆位點(diǎn)選擇標(biāo)記（耐藥性，LacZ）獨(dú)立的復(fù)制單位種類：

質(zhì)粒噬菌體酵母人工染色體（YAC）反轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)載體等當(dāng)前3頁(yè)，總共25頁(yè)。當(dāng)前4頁(yè)，總共25頁(yè)。pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE.coli.當(dāng)前5頁(yè)，總共25頁(yè)。pET-32cloning/expressionregion當(dāng)前6頁(yè)，總共25頁(yè)。Vector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET-32a-SmPR10當(dāng)前7頁(yè)，總共25頁(yè)。

質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來(lái)達(dá)到的目的。當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液(堿性條件pH12.5)中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，由于染色體DNA與質(zhì)粒DNA拓樸構(gòu)型不同，染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入乙酸鉀溶液pH恢復(fù)至中性時(shí),在高鹽濃度的情況下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀；不同的是，質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，保持可溶狀態(tài)而留在上清中。這樣，通過(guò)離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)?？捎梅勇确鲁樘徇M(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質(zhì)粒DNA。>4000kb1kb到200kb當(dāng)前8頁(yè)，總共25頁(yè)。實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑（一）儀器1.恒溫?fù)u床2.超凈工作臺(tái)3.高壓滅菌鍋4.高速臺(tái)式離心機(jī)5.微量取液器當(dāng)前9頁(yè)，總共25頁(yè)。當(dāng)前10頁(yè)，總共25頁(yè)。當(dāng)前11頁(yè)，總共25頁(yè)。當(dāng)前12頁(yè)，總共25頁(yè)。當(dāng)前13頁(yè)，總共25頁(yè)。（二）材料大腸桿菌E.coliDH5α含重組質(zhì)粒pET-32a-SmPR10當(dāng)前14頁(yè)，總共25頁(yè)。（三）試劑1.LB液體培養(yǎng)基（1L）胰蛋白胨10g

酵母提取物5gNaCl10g

加去離子水至800ml，攪拌，使溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1升，高壓蒸汽滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基（1L）在上述LB液體培養(yǎng)基（1L）中加入瓊脂粉15g。

當(dāng)前15頁(yè)，總共25頁(yè)。2.溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）；EDTA（10mmol/L）3.溶液Ⅱ：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鮮配制）4.溶液Ⅲ：60ml的5mol/LKAC；11.5ml的冰醋酸；28.5mlH2O溶液I：低濃度的葡萄糖溶液使細(xì)胞處于低滲狀態(tài)而細(xì)胞澎脹；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞DNA。

EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。

Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍。溶液II：SDS的作用：破壞細(xì)胞膜；解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。

NaOH(pH>12)的作用：破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液III：由KAc與HAc組成，是pH值為5.5的高鹽溶液。能中和溶液II的堿性，使DNA復(fù)性。但是質(zhì)粒DNA與染色體DNA復(fù)性的速度不同。K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離。當(dāng)前16頁(yè)，總共25頁(yè)。5.氨芐青霉素（Amp）用無(wú)菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.RNaseA

將RNA酶A溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。7.酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇(24:1)，乙醇，75%乙醇。

當(dāng)前17頁(yè)，總共25頁(yè)。實(shí)驗(yàn)步驟

質(zhì)粒的提取

1.用滅菌的牙簽挑取單菌落放入1-2mlLB液體培養(yǎng)基（含Amp0.1mg/ml）中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2.將菌液倒入1.5mlEppendorf管中，10,000rpm離心1min，棄上清液。3.加入100lSolutionI，渦旋使細(xì)胞充分懸浮。4.加入200lSolutionII，立即上下顛倒離心管5-10次，使之混勻（注意動(dòng)作輕），冰上放置5min。5.加入150lSolutionIII，立即上下顛倒離心管5-10次，使之混勻（注意動(dòng)作輕），冰上放置5min。當(dāng)前18頁(yè)，總共25頁(yè)。6.15,000rpm，離心10min，將上清移至一干凈的1.5mlEppendorf管中，注意所取體積（約400l）。7.加入等體積酚/氯仿（1:1），顛倒數(shù)次混勻（注意動(dòng)作輕），12,000rpm，4℃，離心3min，取上清液。8.小心吸取上清液中至一干凈的1.5mlEppendorf管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），顛倒數(shù)次混勻，12,000rpm，4℃，離心3min，取上清液。當(dāng)前19頁(yè)，總共25頁(yè)。9.小心吸取上清液中至一干凈的1.5mlEppendorf管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻，于冰上放置10min，4℃離心，15,000rpm，10min。10.棄上清，加1ml75%乙醇漂洗沉淀，4℃離心，10,000rpm，5min。11.去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干燥沉淀。12.加入50lTEbuffer，室溫振蕩溶解質(zhì)粒DNA。當(dāng)前20頁(yè)，總共25頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增1.挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至2mlLB培養(yǎng)液中（含Amp100g/ml)37℃搖蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2.取1ml菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)液三角瓶中(含Amp100g/ml）,37℃搖蕩培養(yǎng)過(guò)夜。37℃振搖過(guò)夜37℃振搖過(guò)夜當(dāng)前21頁(yè)，總共25頁(yè)。

Tiangen質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（實(shí)際用）操作過(guò)程1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2.將1-2ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液加入1.5ml離心管中，12,000rpm離心1分鐘，并棄去上清液。如有需要，可多次重復(fù)步驟2，以收集更多細(xì)菌菌體。但勿過(guò)量，以免影響提取質(zhì)粒的質(zhì)量。3.加200l溶液P1（用前檢查是否已加入RNaseA），重懸細(xì)菌體沉淀，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。當(dāng)前22頁(yè)，總共25頁(yè)。4.加200l溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意不要?jiǎng)×艺駝?dòng)，以防止基因組DNA被打斷，注意不要讓反應(yīng)持續(xù)超過(guò)5分鐘。5.加300l溶液P3，立即輕柔顛倒離心管6-8次，充分混勻，此時(shí)溶液應(yīng)該出現(xiàn)白色絮狀沉淀。6.12,000rpm離心10分鐘。如離心機(jī)轉(zhuǎn)速不夠可延長(zhǎng)離心時(shí)間，直至形成緊密的白色沉淀。7.將步驟6離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12,000rpm離心30-60秒，并棄去接液管內(nèi)液體。8.向吸附柱CP3內(nèi)加600l漂洗液PW，12,000rpm離心30-60秒，并棄去收集管內(nèi)廢液。9.重復(fù)第8步一次。當(dāng)前23頁(yè)，總共25頁(yè)。10.將吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm離心2分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP3開(kāi)蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。11.將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加40l洗脫緩沖液EB，室