胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)

關(guān)于胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第1頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

指對(duì)動(dòng)物早期胚胎或配子所進(jìn)行的多種顯微操作和處理技術(shù)。包括體外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)。即各種胚胎操作技術(shù)。研究對(duì)象：胚胎工程：主要是高等脊椎動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物研究水平：細(xì)胞水平定義：操作對(duì)象：早期胚胎或配子第2頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第2節(jié)胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第3頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、人工授精和胚胎體外培養(yǎng)（一）人工授精：1、精子的獲取2、卵細(xì)胞的獲取3、體外授精第4頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（一）人工授精：1、精子的獲?。孩倏刹杉课唬翰G丸、附睪、射出的精子及雌性生殖道內(nèi)。②方法：常用人工采集的方式采集精液。③精液的保存：低溫保存第5頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（一）人工授精：2、卵細(xì)胞的獲?。孩倏刹杉课唬郝殉?、輸卵管、子宮卵母細(xì)胞②方法：手術(shù)法：非手術(shù)法：中小型動(dòng)物，如鼠、兔、羊大型動(dòng)物，如牛超數(shù)排卵沖洗輸卵管采卵子宮沖卵第6頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五超排卵技術(shù)

利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個(gè)過程就稱為超數(shù)排卵。第7頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五超數(shù)排卵定義：指人為注射外源性促性腺激素，促使卵巢排出更多成熟卵細(xì)胞。下丘腦促性腺激素釋放激素垂體促性腺激素卵巢排卵第8頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五卵細(xì)胞發(fā)生的激素調(diào)節(jié)垂體促卵泡刺激素（FSH）促黃體生成激素（LH）促進(jìn)卵泡細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育促進(jìn)卵泡細(xì)胞釋放更多雌激素促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)下丘腦促性腺激素釋放激素釋放卵細(xì)胞卵巢第9頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（一）人工授精：3、體外授精：獲取的卵細(xì)胞培養(yǎng)液MⅡ中卵母細(xì)胞獲取的精液精子精漿離心分離精子獲能培養(yǎng)獲能的精子培養(yǎng)液法顯微注射法受精卵第10頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、人工授精和胚胎體外培養(yǎng)（二）體外培養(yǎng)受精卵發(fā)育培養(yǎng)液由于不同時(shí)期的胚胎生理代謝不同，故需配置一系列含有不同成分的培養(yǎng)液（CO2、O2、AA、核苷酸、無(wú)機(jī)鹽、能源物質(zhì)、維生素、激素、動(dòng)物血清等。）早期胚胎冷凍保存植入受體第11頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

胚胎體外培養(yǎng)是胚胎工程的核心技術(shù)，但是由于哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育條件異常復(fù)雜，因此，只能培養(yǎng)不同階段的胚胎，目前還無(wú)從受精卵培養(yǎng)到新生兒的全體外培養(yǎng)。第12頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

指將雌性動(dòng)物體內(nèi)的早期胚胎，或者通過體外受精及其他方式獲得的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動(dòng)物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個(gè)體的技術(shù)。二、胚胎移植技術(shù)1、定義：第13頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1、定義：良種雌性動(dòng)物體內(nèi)的早期胚胎體外授精或其他方式獲得的胚胎（超數(shù)排卵獲得多個(gè)胚胎）植入其他雌性動(dòng)物供體發(fā)育個(gè)體受體二、胚胎移植技術(shù)條件：生產(chǎn)價(jià)值高、性狀優(yōu)良條件：同種、同期發(fā)情、健康胚胎來源第14頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五胚胎的來源：雌性動(dòng)物的早期胚胎或體外受精及其他方式得到的胚胎。供體：提供胚胎的個(gè)體。受體：接受胚胎的個(gè)體。受體的條件：同種、生理狀態(tài)相同。第15頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)體內(nèi)授精超數(shù)排卵2、胚胎的來源：二、胚胎移植技術(shù)體外授精供體多個(gè)卵細(xì)胞多個(gè)早期胚胎取出手術(shù)法非手術(shù)法多個(gè)受精卵早期胚胎第16頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3、胚胎植入：二、胚胎移植技術(shù)手術(shù)法：非手術(shù)法：取出輸卵管和子宮，注入胚胎通過一定的器械，注入胚胎第17頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（7）胚胎的移植方法一：手術(shù)法具體做法：引出受體子宮和卵巢，將胚胎注入子宮角，縫合創(chuàng)口。方法二：非手術(shù)法將裝有胚胎的移植管送入受體母牛子宮的相應(yīng)部位，注入胚胎。第18頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4、基本程序：以牛為例第19頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五供體母牛良種公牛受體母牛同期發(fā)情處理超數(shù)排卵精子受精卵早期胚胎收集胚胎沖胚發(fā)育檢測(cè)健康胚胎胚胎移植保存手術(shù)法非手術(shù)法分娩胚胎移植后代體內(nèi)授精多個(gè)卵細(xì)胞第20頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五良種母牛卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)良種公牛精子體外獲能體外受精良種牛體外受精胚胎胚胎移植受體牛良種犢牛成熟期牛屠宰加工廠市場(chǎng)采集卵巢中的卵母細(xì)胞“試管?！惫S化生產(chǎn)的技術(shù)流程圖超數(shù)排卵有性生殖第21頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

試管動(dòng)物與克隆動(dòng)物相比生殖方式：技術(shù)手段：有性生殖核移植技術(shù)、胚胎移植體外受精胚胎移植無(wú)性生殖第22頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五5、胚胎移植的現(xiàn)狀和意義1)保持供體優(yōu)良特性(加速育種工作和品種改良)2)節(jié)約成本\費(fèi)用(大量節(jié)省購(gòu)買種畜的費(fèi)用)；3)大規(guī)模繁殖(一胎多產(chǎn))；4)

保存品種資源和保護(hù)瀕危物種；5)充分發(fā)揮雌性個(gè)體的繁殖潛力,縮短供體本身的繁殖周期。第23頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第24頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三、胚胎分割優(yōu)勢(shì):可成倍增加胚胎數(shù)量，可以快速繁殖良種畜。概念:將早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)。第25頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一）胚胎分割技術(shù)研究概況

胚胎分割技術(shù)開始于Nicholas（1942）對(duì)大鼠2-細(xì)胞卵裂球的分離和培養(yǎng)。其后，Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的發(fā)展規(guī)律,得到了世界上首例半胚來源的活體動(dòng)物。20世紀(jì)70年代以來,隨著胚胎培養(yǎng)及移植技術(shù)的發(fā)展和提高,哺乳動(dòng)物胚胎分割技術(shù)取得了突破性進(jìn)展。目前胚胎分割的研究方向也正向著簡(jiǎn)單化和實(shí)用化發(fā)展。我國(guó)1986年張涌等首次利用胚胎分割方法獲得同卵雙生小鼠，1987年又獲得同卵雙生山羊。1986年竇忠英等獲得分割胚牛犢，1990年又獲得奶牛四分胚后代。1987年譚麗玲等獲得同卵雙生犢。第26頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第27頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五特點(diǎn)：

后代具有相同的遺傳物質(zhì)，克隆選擇的胚胎：發(fā)育良好的，形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚使用的主要儀器：

體視顯微鏡、顯微操作儀、切割刀、切割針注意:

將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分裂第28頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二）胚胎分割的基本程序切割器具的準(zhǔn)備；胚胎的預(yù)處理；胚胎的分割；分割胚的培養(yǎng)；分割胚的移植；第29頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.切割器具體視顯微鏡；顯微操作儀；胚胎固定管；胚胎分割針；第30頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.胚胎的預(yù)處理用鏈霉蛋白酶處理鏈霉蛋白酶的作用：使透明帶軟化、變薄或去除第31頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.胚胎的分割方法酶解法：用鏈霉蛋白酶處理機(jī)械法：用分割針切開透明帶第32頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五胚胎分割的基本操作選擇良好的桑椹胚或囊胚移入培養(yǎng)皿中，用分割針或分割刀片將其切開，吸出其中的半個(gè)胚胎注入透明帶中或直接移植給受體。第33頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第34頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4.分割胚的培養(yǎng)；

原因：早期胚胎切割后發(fā)育能力低，一般是經(jīng)包埋后移植到中間受體的輸卵管中培養(yǎng)幾天至囊胚，再?gòu)妮斅压苤谢厥张咛?，最后移植給受體。方法：體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)（需瓊脂包埋）第35頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五瓊脂包埋的作用固定胚胎便于回收第36頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五分割胚的移植要求：胚胎分割后可以直接移植給受體，也可以進(jìn)行超低溫冷凍保存。為提高冷凍胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在體內(nèi)或體外培養(yǎng)到桑椹或囊胚階段，再進(jìn)行冷凍。第37頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五受精卵分裂

早期胚胎胚胎分割基本過程代孕母牛植入植入分割第38頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五胚胎分割的基本過程胚胎移入培養(yǎng)液分割胚胎（機(jī)械法、酶處理）移植胚胎給受體著床產(chǎn)仔第39頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三）胚胎分割技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)用：在畜牧方面：擴(kuò)大優(yōu)良家畜的數(shù)量在研究方面：培養(yǎng)遺傳特性相同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別鑒定存在問題：如：早期胚胎細(xì)胞的分化和定位的發(fā)育機(jī)制不同階段胚胎細(xì)胞的分化時(shí)間和發(fā)育潛力第40頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第41頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五四、胚胎干細(xì)胞核移植技術(shù)1.概念：（胚胎干細(xì)胞）：簡(jiǎn)稱ES或EK細(xì)胞，是由早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞。第42頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.特點(diǎn):1)形態(tài)：體積小、細(xì)胞核大、核仁明顯。

2)功能：具有發(fā)育的全能性；是一種高度未分化的細(xì)胞，可分化為成年動(dòng)物體內(nèi)任何一種組織和器官。

3）應(yīng)用：在體外培養(yǎng)的條件下，可以增殖而不發(fā)生分化；對(duì)它可以進(jìn)行冷凍保存，也可以進(jìn)行遺傳改造。3.主要用途：

(1)治療人類的某些頑癥

(2)培育出人造組織器官，用于器官移植

(3)是研究體外細(xì)胞分化的理想材料第43頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的構(gòu)成胚胎成纖維細(xì)胞作用：抑制細(xì)胞分化成纖維細(xì)胞（fibroblast）：是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymalcell)分化而來。細(xì)胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核卵圓形，核仁大而明顯。細(xì)胞功能活動(dòng)旺盛，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)。成纖維細(xì)胞對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復(fù)有著十分重要的作用。飼養(yǎng)層細(xì)胞（feederlayer）：在正常機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞除了獲得一些血液來的營(yíng)養(yǎng)外，還在細(xì)胞與細(xì)胞之間互換特殊的物質(zhì)，用于分裂分化和營(yíng)養(yǎng)等。因而，在細(xì)胞體外培養(yǎng)中，除了正常的培養(yǎng)基外，先培養(yǎng)一層特殊的細(xì)胞，然后再在其上接種要實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，這樣更能模擬體內(nèi)環(huán)境。這些特殊的細(xì)胞就是飼養(yǎng)層細(xì)胞，通常是成纖維類細(xì)胞，這些細(xì)胞可以提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞更好的營(yíng)養(yǎng)，有的分化研究則是必須有飼養(yǎng)層細(xì)胞。

第44頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.胚胎干細(xì)胞的獲得時(shí)期：囊胚或囊胚期以前如小鼠：桑椹胚、囊胚人體：囊胚、原始生殖細(xì)胞培養(yǎng)：置于含飼養(yǎng)層的培養(yǎng)液中培養(yǎng)方法：原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)的作用：抑制胚胎干細(xì)胞分化第45頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一）胚胎干細(xì)胞核移植程序飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立胚胎干細(xì)胞的獲得胚胎干細(xì)胞的核移植第46頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第47頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.胚胎干細(xì)胞的核移植指把胚胎干細(xì)胞核移植到去核的卵細(xì)胞中，經(jīng)過胚激活、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植后直接由受體完成克隆動(dòng)物的技術(shù)。第48頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五胚胎干細(xì)胞核移植：

第49頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二）胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用培養(yǎng)克隆動(dòng)物的核供體獲得基因敲除動(dòng)物治療性克隆第50頁(yè)，共52頁(yè)，2023