微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察１、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。２、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。，以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。１）細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。２）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。革蘭氏染色:革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G—菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色步驟：（1）涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。（2）晾干：與簡單染色法相同。（3）固定，與簡單染色法相同（4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1分鐘。（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。（6）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗。（9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。（12）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。（13）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干Aseptictechnique:Streakplate:PourplatePourplateSpreadplateSpreadplate二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：1、尿素酶（Urease）試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?，?xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。2、氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。注意事項(xiàng)：鹽酸二甲基對(duì)苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，并在冰箱內(nèi)保存，如溶液變?yōu)榧t褐色，即不宜使用。鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對(duì)苯撐二胺呈紅色反應(yīng)，若用它來挑取菌苔，會(huì)出現(xiàn)假陽性，故必須用白金絲或玻璃棒（或牙簽）來挑取菌苔。在濾紙上滴加試劑，以剛剛打濕濾紙為宜，如濾紙過濕，會(huì)防礙空氣與菌苔接觸，從而延長了反應(yīng)時(shí)間，造成假陰性。3、過氧化氫酶的測(cè)定過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。試劑：3－10％過氧化氫（H2O2）菌種培養(yǎng)：將測(cè)試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)18－24h。試驗(yàn)方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1環(huán)培養(yǎng)18－24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。注意事項(xiàng)：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測(cè)試菌所生長的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球。4、甲基紅（MethylRed）試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。試驗(yàn)方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于MR－VP生化鑒定管，于36通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。5、V-P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。試驗(yàn)方法：１）O’Meara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管1~2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?8~50°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。２）Barritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。３）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí)，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。6、含碳化合物的利用細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產(chǎn)生代謝這種化合物的有關(guān)酶系，因而作為鑒定依據(jù)。測(cè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因種而異?，F(xiàn)介紹1種合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有些細(xì)菌還可適當(dāng)補(bǔ)加各種維生素。培養(yǎng)基可制成液體，分裝試管，也可制成固體平板?？捎糜跍y(cè)定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機(jī)酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳?xì)浠衔锏?。糖的含量一般?％，醇類酚類等的含量一般為0.1－0.2％，氨基酸的含量一般為0.5％。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?，可在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，或加入到45℃的固體培養(yǎng)基中，振蕩后立即倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，某些醇類和酚類不必滅菌。接種和觀察結(jié)果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗(yàn)結(jié)果。平板培養(yǎng)用接種環(huán)點(diǎn)種，液體培養(yǎng)則用直針接種。每一測(cè)定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照。適溫培養(yǎng)2、5、7天后觀察，凡測(cè)定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中生長情況，明顯超過空白培養(yǎng)基的生長量為陽性，否則為陰性。假若兩種培養(yǎng)基上生長情況差別不明顯，開在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種3次，如差別仍不明顯則以陰性論。7、葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中，糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是1項(xiàng)重要依據(jù)。細(xì)菌對(duì)糖類的利用有2種類型：1種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時(shí)所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此，Hugh和Leifson提出一種含有低有機(jī)氮的培養(yǎng)基，用以鑒定細(xì)菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一試驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來測(cè)定細(xì)菌從其他糖類或醇類產(chǎn)酸的能力。（1）接種：以18－24h的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養(yǎng)基中，每株菌接4管，其中2管用油封蓋（凡士林：液體石蠟＝1：1混合后滅菌），約加0.5－1厘米厚，以隔絕空氣為閉管。另2管不封油為開管，同時(shí)還要有不接種的閉管作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1、2、4、7天觀察結(jié)果。（2）結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸――僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（1－2d），后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。8、糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。注：對(duì)于糖醇類發(fā)酵現(xiàn)在一般用糖、醇類細(xì)菌微量生化鑒定管在36℃18－24h即可出結(jié)果。9、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗(yàn)有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾?。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。10、靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。12、氨基酸脫羧酶的測(cè)定有些細(xì)菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反應(yīng)在偏酸的條件下進(jìn)行。當(dāng)培養(yǎng)基含胺類時(shí)呈堿性反應(yīng)，使指示劑變色。接種與觀察結(jié)果：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種，直接接種。接種后封油，對(duì)照管與測(cè)定管同時(shí)接種封油。腸肝菌科的細(xì)菌于37℃培養(yǎng)4天觀察。當(dāng)指示劑呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。對(duì)照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。13、硫化氫（H2S）試驗(yàn)有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。試驗(yàn)方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養(yǎng)24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天。紙條變黑為陽性。14、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源，及磷酸胺作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。接種與觀察結(jié)果：取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培養(yǎng)3－7天，培養(yǎng)基呈堿性（藍(lán)色）者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性。15、利用丙二酸鹽試驗(yàn)丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌鑒定中的一個(gè)鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個(gè)環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。接種和觀察結(jié)果：用幼齡菌種接種測(cè)定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)1－2d，觀察培養(yǎng)基變色情況。如測(cè)定培養(yǎng)基生長并變藍(lán)色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果。反之，如測(cè)定培養(yǎng)基未變色，而空白對(duì)照培養(yǎng)基生長，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。16、葡萄糖酸鹽的氧化假單胞菌屬和腸道桿菌科的細(xì)菌，可氧化葡萄糖酸為2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸無還原性基團(tuán)，氧化后形成酮基，則可將斐林氏試劑的呈藍(lán)色的銅鹽還原為磚紅色的Cu2O沉淀。試驗(yàn)方法：用pH7.2的磷酸緩沖液配制成含1％葡萄糖酸鹽（可用葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鈣）的溶液。分裝試管，每管2mL。刮取適溫培養(yǎng)18－24小時(shí)的菌苔至2mL的葡萄糖酸鹽溶液中制成濃的菌懸液，置30℃過夜，然后每管加入0.5mL的斐林試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘，試管中液體由藍(lán)色變?yōu)辄S綠，綠橙色或出現(xiàn)紅色沉淀者為陽性反應(yīng)，如溶液不變色者為陰性。17、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對(duì)照。本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。18、β-半乳糖苷酶（ONPG）的測(cè)定本試驗(yàn)應(yīng)用于腸肝菌科的鑒定。測(cè)定步驟：將測(cè)定菌接種于TSI斜面上，培養(yǎng)于37℃18h（或其他最適溫度）挑取1大環(huán)菌苔入約0.25mL的生理鹽水中制成菌懸液，每管加1滴甲苯，搖勻（有助于酶的釋放），于37℃放置5分鐘。在菌懸液中加入0.25mL的0.75mol/LONPG，測(cè)定管置于37℃水浴培養(yǎng)。經(jīng)30分、1、2、3、……24h進(jìn)行觀察，如有黃色者則為陽性。19、耐鹽性試驗(yàn)本試驗(yàn)是觀察滲透壓對(duì)細(xì)菌生長的影響。由于不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特征。一般可根據(jù)不同種類的菌株，選擇其適合生長的培養(yǎng)基，在其中加入不同量的NaCl，接種后觀察其生長與否，以判斷其耐鹽性。以肉湯培養(yǎng)液根據(jù)鑒定需要，配成不同濃度的NaCl，如2％、3.5％、5％、7％、10％等。培養(yǎng)基要求十分澄清，接種時(shí)應(yīng)采用幼齡菌液，直針接種，適溫培養(yǎng)3－7d，與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)生長情況。20、卵磷脂酶的測(cè)定菌體如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿。接種與觀察結(jié)果：將測(cè)試菌的菌液，環(huán)接在有卵黃的試管和不加卵黃的對(duì)照管中，適溫培養(yǎng)1、3或5天觀察。假若與對(duì)照管相比較，在卵黃胰胨液中或表面，形成白色沉淀者，則為陽性反應(yīng)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿，說明有卵磷酶的存在。另一種方法：以無菌操作取出卵黃，放入滅菌的三角瓶中，加相當(dāng)于等量的生理鹽水搖勻后，取10mL卵黃液加入到溶化的約50－55℃的200mL肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，制成卵黃平板，過夜后即可使用。接種與觀察結(jié)果：將測(cè)試菌點(diǎn)接在卵黃平板上，每皿可分散點(diǎn)接4－5株菌、（芽孢桿菌以點(diǎn)接1－2株菌為宜）以不影響結(jié)果觀察為度，如測(cè)試厭氧菌，則須在上面加蓋無菌的蓋玻片。每株菌至少重復(fù)點(diǎn)接兩皿。適溫培養(yǎng)1－2d觀察，在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，說明該菌株有卵磷脂酶存在。21、石蕊牛奶的反應(yīng)牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時(shí)呈淡紫色，酸性時(shí)呈粉紅色，堿性呈藍(lán)色，還原時(shí)則自上而下地褪色變白。細(xì)菌對(duì)牛奶的作用有一下幾種：產(chǎn)酸――細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。產(chǎn)堿――細(xì)菌分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。胨化――細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較澄清。酸凝固――細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變化，當(dāng)酸度很高時(shí)，可使牛奶凝固。凝乳酶凝固――有些細(xì)菌能產(chǎn)生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此時(shí)石蕊常呈藍(lán)色或不變色。還原――細(xì)菌生長旺盛，使培養(yǎng)基氧化還原電位降低，因此石蕊還原褪色。接種與觀察結(jié)果：接種待測(cè)菌株，適溫培養(yǎng)3、5、7d或14d，按上述特征觀察和記錄牛奶產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應(yīng)。22、酪素水解試驗(yàn)（酪蛋白水解）牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中（或用50mL脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至45－50℃時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分干燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上，每皿可點(diǎn)接3－5株菌。適溫培養(yǎng)1、3、5天，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制該培養(yǎng)基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。23、酪氨酸水解將L－酪氨酸0.5g懸浮于10mL蒸餾水中，8磅20分鐘滅菌，然后于100mL無菌的營養(yǎng)肉湯瓊脂混合，傾倒平板，待凝固后，將測(cè)試菌接種于平皿上，培養(yǎng)7到14d，記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明。24、苯丙氨酸脫氨試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌（如變形桿菌）具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化鐵呈藍(lán)綠色。本試驗(yàn)用于腸肝菌科和某些芽孢桿菌屬的鑒定。接種與觀察結(jié)果：將菌種接種于該培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)3－7d（某些芽孢桿菌須培養(yǎng)21d）。取10％的FeCl3水溶液4－5滴，滴加在生長菌苔的斜面上，當(dāng)斜面和試劑液面處呈藍(lán)綠色時(shí)為陽性反應(yīng)，表示從苯丙氨酸形成苯丙酮酸。25、產(chǎn)糊精結(jié)晶試驗(yàn)?zāi)承┬柩跹挎邨U菌能產(chǎn)生淀粉酶，使淀粉水解為糊精。該反應(yīng)僅用于區(qū)別多粘芽孢菌，浸麻芽孢菌和環(huán)狀芽孢菌的培養(yǎng)物。在大試管中（200X20mm）裝碾過的小麥（或燕麥）0.5g，CaCO30.2g，蒸餾水10mL，滅菌后接種，35℃培養(yǎng)3、5和7d后，取1滴盧哥爾氏碘液混勻，干燥后，用顯微鏡觀察有暗褐色或藍(lán)色的六角形結(jié)晶的糊精，假若大量形成，則排列為扇形或針狀。26、從甘油產(chǎn)生二羥基丙酮本試驗(yàn)主要是用于區(qū)分醋酸單胞菌屬和假單胞菌屬以及某些芽孢桿菌的鑒定。生酮反應(yīng)是由相應(yīng)的多元醇的脫氫酶的作用，此反應(yīng)就是測(cè)定有否這些脫氫酶。接種與觀察結(jié)果：融化三角瓶中的培養(yǎng)基，倒成平板，凝固后在平板上劃短線接種，適溫培養(yǎng)10天，在平板上倒入斐林試劑A、B混合液，以覆蓋菌落為度，2小時(shí)內(nèi)檢查，若在菌落周圍出現(xiàn)紅色的暈者為陽性反應(yīng)。為了能掌握這一試驗(yàn)，可接種多粘芽孢桿菌作陽性對(duì)照。27、厭氧硝酸鹽產(chǎn)氣在厭氧情況下，有些好氧細(xì)菌，能以硝酸鹽代替分子氧作為受氫體，進(jìn)行厭氧呼吸，將硝酸鹽還原為氣態(tài)氮，即為土壤中的反硝化作用。某些芽孢桿菌，假單胞菌及產(chǎn)堿菌等屬的細(xì)菌具有此反應(yīng)。接種封油：以斜面菌種用接種環(huán)接種后，用凡士林油（凡士林和液體石蠟為1：1）封管，封油的高度約1厘米。必須同時(shí)接種不含有硝酸鉀的肉汁胨培養(yǎng)液作對(duì)照。觀察結(jié)果：培養(yǎng)2－7d，觀察在含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有否生長和產(chǎn)生氣泡。如有氣泡產(chǎn)生，表示反硝化作用產(chǎn)生氮?dú)猓瑸殛栃苑磻?yīng)。但如不含硝酸鉀的對(duì)照培養(yǎng)基也可產(chǎn)生氣泡，則只能按可疑或陰性處理。28、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)本試驗(yàn)作為區(qū)分某些芽孢桿菌的鑒定和黃單胞菌屬的鑒定之用。接種和觀察結(jié)果：以幼齡菌種接種于上述培養(yǎng)液中，適溫培養(yǎng)4周（高溫芽孢菌培養(yǎng)2周），取1mL培養(yǎng)物，和1.5mL50％的；硫酸混合，靜置片刻，在酸性混合物中有針狀結(jié)晶出現(xiàn)為陽性，證明從馬尿酸鹽形成安息香酸。29、對(duì)疊氮化鈉的抗性本試驗(yàn)用于高溫芽孢桿菌的測(cè)定。接種和觀察結(jié)果：取1環(huán)幼齡的菌液，接種于上述培養(yǎng)基中，同時(shí)接種營養(yǎng)肉湯作為對(duì)照。45℃培養(yǎng)7至14d觀察生長情況。30、氰化鉀試驗(yàn)氰化鉀（KCN）是呼吸鏈末端抑制劑。能否在含有氰化鉀的培養(yǎng)基中生長，是鑒別腸桿菌科各屬常用的特征之一。接種和觀察結(jié)果：用幼齡菌種接種于加氰化鉀的測(cè)定培養(yǎng)基和未加氰化鉀的空白培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)1－2d，觀察生長情況。能在測(cè)定培養(yǎng)基上生長者，表示氰化鉀對(duì)測(cè)定菌無毒害作用，為陽性。若在測(cè)定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基上均不生長，表示空白培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不適于測(cè)定菌的生長，必須選用其它合適的培養(yǎng)基。而測(cè)定菌在空白培養(yǎng)基上能生長，在含氰化鉀的測(cè)定培養(yǎng)基上不生長，為陰性結(jié)果。應(yīng)該注意：氰化鉀是劇毒藥品，操作時(shí)必須小心。培養(yǎng)基用畢，每管加幾粒硫酸亞鐵和0.5mL20％KOH以解毒，然后清洗。31、對(duì)溶菌酶抗性的測(cè)定在100mL的三角瓶中，放入60－65mL無菌的0.01mol/LHCL，在其中加入0.1g溶菌酶，瓶上塞無菌棉花，在小火上煮沸20分鐘后，冷到室溫，加無菌的0.01mol/LHCL補(bǔ)足到100mL。取1mL溶菌酶溶液與99mL無菌的肉湯培養(yǎng)液混合，分裝無菌試管，每管2.5mL，在含有0.001％溶菌酶肉湯管子及無溶菌酶的營養(yǎng)肉湯對(duì)照管中，各接種1環(huán)菌液，適溫培養(yǎng)5－7d，記錄兩管的生長情況。32、在pH5.7營養(yǎng)肉湯上的生長本試驗(yàn)應(yīng)用于芽孢桿菌屬中種的鑒定。接種和觀察結(jié)果：取菌液一環(huán)，接種于上述培養(yǎng)基中，同時(shí)接種普通肉湯液（7.2pH）作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1－3d后觀察生長情況。該培養(yǎng)液要求十分澄清，pH必須準(zhǔn)確，最好用pH計(jì)調(diào)測(cè)。33、需氧性試樣若在培養(yǎng)基中加入還原劑，如巰基醋酸鈉和甲醛次硫酸鈉等，以除去培養(yǎng)基中的氧氣或氧化型物質(zhì)，使厭氧菌能在有氧情況下生長。接種與觀察結(jié)果：用1小環(huán)（外徑1.5毫米的接種環(huán)）的肉湯菌液，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，必須穿刺到管底。30℃培養(yǎng)，分別在3至7天觀察結(jié)果。如細(xì)菌在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。34、明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽性，10~20min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。35、淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。試驗(yàn)方法：以18~24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培養(yǎng)24~48h，或于20°培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。36、生長溫度的測(cè)定細(xì)菌生長的最高、最適和最低溫度，常常是某些細(xì)菌鑒定的特征之一。測(cè)定細(xì)菌的生長溫度，要求培養(yǎng)液十分清晰（如普通肉湯培養(yǎng)液），并采用液體菌種直針接種（不用接種環(huán)接種）。放置于恒溫水浴培養(yǎng)。指示溫度計(jì)應(yīng)放在同樣的試管和培養(yǎng)基內(nèi)，在指定溫度下培養(yǎng)2－5d，觀察生長情況。在接近0℃的低溫培養(yǎng)，則觀察時(shí)間可延長至7－10d，甚至30d。觀察記錄結(jié)果：目測(cè)生長情況，與未接種的空白培養(yǎng)基對(duì)比，注意混濁度、沉淀物和懸浮物等項(xiàng)，并分級(jí)記錄如下：（1）“＋“：表示生長良好；與對(duì)照管相比，可清楚地判定是混濁的。（2）“＋－“：表示生長差；與對(duì)照管相比，只有在某一觀察角度時(shí)方能看到明顯的混濁。（3）“－“：表示不生長；在適宜的角度下觀察，與對(duì)照無差異?？傊囵B(yǎng)5d，能生長者均按生長計(jì)，否則按不生長計(jì)，凡培養(yǎng)5d仍屬可疑者或不生長者必須重測(cè)，在重測(cè)時(shí)，可能出現(xiàn)有時(shí)生長，有時(shí)不生長的不穩(wěn)定現(xiàn)象，這可能有兩種原因：一種是水浴溫度不穩(wěn)定，培養(yǎng)時(shí)溫度波動(dòng)大；另一種原因可能是所測(cè)定的溫度，恰好是測(cè)定菌的臨界生長溫度，在這種情況下，可用提高一度或降低一度的辦法肯定之。必須注意，當(dāng)測(cè)定的試管較多時(shí)，不可將試管捆成一捆浸于水浴中，這樣捆著的試管內(nèi)外溫度不一致，易出現(xiàn)誤差。最好用特制試管架放試管，所用溫度計(jì)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)標(biāo)定過。37、形成芽孢的培養(yǎng)基形成芽孢是芽孢桿菌的關(guān)鍵性特征，但不是所有的芽孢桿菌都能在任何條件下形成芽孢。在鑒定細(xì)菌時(shí)，為了確定是否屬芽孢菌，需要對(duì)那些在一般條件下不形成芽孢的細(xì)菌，采用生孢子培養(yǎng)基，來確定是否能形成芽孢。38、O/129的敏感性試驗(yàn)O/129即2，4－二氨基－6，7－二異丙醇喋啶，為弧菌抑制劑。該試驗(yàn)用于弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬的鑒定。取2，4－二氨基－6，7－二異丙醇喋啶150mg，溶于10mL1：1的乙醇：二乙基乙醚中。把6mm大小的濾紙片浸入該溶液后取出，在空氣中晾桿，然后放在帶菌的半固體培養(yǎng)基上做擴(kuò)散敏感試驗(yàn)。三、血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。１、凝集反應(yīng)顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)（Agglutinationreaction）。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體。１）直接凝集反應(yīng)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)，稱為直接凝集反應(yīng)(Directagglutionreaction)。a.玻片凝集法。是一種常規(guī)的定性試驗(yàn)方法。原理是用已知抗體來檢測(cè)未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分種后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即陽性反應(yīng)，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡便，但不能進(jìn)行定量測(cè)定。b.試管凝集法。是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來檢測(cè)血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗(yàn)。因?yàn)橐獪y(cè)定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時(shí)觀察，血清最高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象的，為該抗血清的凝集效價(jià)。２）間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無關(guān)的，顆粒狀微球表面，然后與相應(yīng)抗體（抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)(Indirectagglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合。就出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性很高。２、沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（Precipitation）。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。１）環(huán)狀沉淀反應(yīng)：是一種定性試驗(yàn)方法，可用已知抗體檢測(cè)未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對(duì)應(yīng)，則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。２）絮狀沉淀反應(yīng)：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對(duì)應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應(yīng)。３）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，若抗原抗體對(duì)應(yīng)，且二者比例合適，在其擴(kuò)散的某一部分就會(huì)出現(xiàn)白色的沉淀線。每對(duì)抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對(duì)抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種類型。單向擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)。可用于免疫蛋白含量的測(cè)定。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)。由于方法簡便易行，常用于測(cè)定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。３、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(Complementfixationreaction)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，整個(gè)試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統(tǒng)（綿羊細(xì)胞和溶血素）五種成份參加。其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體是相對(duì)應(yīng)的，如果出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對(duì)應(yīng)。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)，能測(cè)出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。

附錄資料：不需要的可以自行刪除鍋爐基礎(chǔ)施工措施(內(nèi)容)項(xiàng)目工程概況及工程量2.1工程概況xx集團(tuán)塔山2×600MW機(jī)組坑口電廠鍋爐房基礎(chǔ)縱向?yàn)镵1、K2、K3、K4、K5、K6六個(gè)基礎(chǔ)軸線，基礎(chǔ)底標(biāo)高為-5.5m，±0.000相當(dāng)于絕對(duì)標(biāo)高（黃海高程）1074.8m?；A(chǔ)設(shè)計(jì)為鋼筋混凝土獨(dú)立基礎(chǔ),承臺(tái)之間設(shè)連梁及剪力墻.其中CT-1基礎(chǔ)2個(gè)，CT-2基礎(chǔ)3個(gè)，CT-3基礎(chǔ)2個(gè)，CT-4基礎(chǔ)8個(gè)，CT-4a基礎(chǔ)7個(gè)，CT-5基礎(chǔ)2個(gè)，CT-5a基礎(chǔ)2個(gè)，CT-5b基礎(chǔ)2個(gè)，CT-6基礎(chǔ)2個(gè)，CT-7基礎(chǔ)4個(gè)，CT-8基礎(chǔ)2個(gè)，CT-8a基礎(chǔ)1個(gè)，CT-9基礎(chǔ)2個(gè)，CT-10基礎(chǔ)2個(gè)?；A(chǔ)承臺(tái)上短柱最大斷面2.2×2.2M,短柱頂標(biāo)高為-0.6M.混凝土強(qiáng)度等級(jí):基礎(chǔ)、拉梁為C35（CT-6、8、8a為C40），短柱、剪力墻為C40。鍋爐基礎(chǔ)澆注時(shí)先澆注至—1.70m標(biāo)高，待地腳螺栓和固定支架安裝完畢后再澆至—0.60m標(biāo)高。2.2主要工程量鋼筋：Φ32101.4TΦ2866.2TΦ2526.2TΦ161.4TΦ148.9TΦ126.9Tφ1447Tφ1211.7Tφ1012.1Tφ85Tφ1648.3T砼：C401252m3C351372m33.作業(yè)準(zhǔn)備工作及條件3.1作業(yè)人力計(jì)劃木工60人鋼筋工30人砼工15人架子工40人測(cè)量工2人機(jī)械工2人電工1人電焊工3人技術(shù)員1人質(zhì)檢員1人施工員2人3.2材料準(zhǔn)備100×100方木10m３50×100方木8m鋼管60T十字扣件12000個(gè)腳手板800塊鉛絲22#1250kg鋼模板2200m2鉛絲12#3.3機(jī)具準(zhǔn)備反鏟1輛自卸汽車5輛機(jī)動(dòng)翻斗車2輛手推翻斗車10輛臺(tái)鉆1臺(tái)對(duì)焊機(jī)1臺(tái)磨光機(jī)2臺(tái)振搗器6臺(tái)砂輪切割機(jī)1臺(tái)鋼筋運(yùn)輸拖板車1輛泵車2臺(tái)罐車3輛4.作業(yè)程序及作業(yè)方法4.1施工順序測(cè)量放線→土方開挖→墊層施工→人工破樁→放線→基礎(chǔ)承臺(tái)鋼筋綁扎→基礎(chǔ)承臺(tái)模板安裝→基礎(chǔ)承臺(tái)混凝土澆筑→短柱鋼筋綁扎→短柱模板安裝→短柱混凝土澆筑4.2主要施工方法4.2.1土方開挖本基坑采用反鏟作業(yè)，自卸汽車運(yùn)土。放坡坡度為1:0.75，基底作業(yè)面寬度為1m，詳見附圖1。根據(jù)設(shè)計(jì)挖方圖，鍋爐間機(jī)械挖方控制深度為-5.6m，機(jī)械挖方控制深基底暫留土層為300厚人工挖土。坡道位置詳見附圖，坡道寬為7.0m。護(hù)欄距邊坡頂緣1.5m處，高度1050mm,立桿間距2000mm，中間加設(shè)一道橫桿，并刷紅白相間油漆條紋。基坑挖土派專人修坡，要求上（下）口拉線修直，邊坡順直平滑。挖方土料運(yùn)于指定堆土（或用土）場(chǎng)地，要求隨時(shí)集中并整形。為防止風(fēng)吹土揚(yáng)，應(yīng)拍實(shí)或淋濕土堆表面。隨時(shí)抄平，控制挖方深度。及時(shí)放出底線，以免超挖或少挖。修坡時(shí)要借助靠尺掛線，做到坡面一致，邊線順直。4.2.2墊層施工土方開挖機(jī)械至-5.3m后將余下的0.3m人工挖除至-5.6m，基槽經(jīng)設(shè)計(jì)人員、監(jiān)理驗(yàn)收合格后用50×100方木支設(shè)模板，墊層砼表面抹平后用木抹子或棕刷拉毛。表面平整度的誤差不超過10mm。4.2.3樁頭施工墊層施工完畢后進(jìn)行破樁頭，嚴(yán)格控制樁頭標(biāo)高，保證伸入承臺(tái)100mm。剔除時(shí)應(yīng)注意保護(hù)好樁插入承臺(tái)內(nèi)的鋼筋，剔除方法為風(fēng)鎬或鑿子在樁側(cè)面剔槽，將箍筋割除，主筋彎出，混凝土鑿除，然后用機(jī)械運(yùn)走。4.2.4架子工程腳手架搭設(shè)地基應(yīng)平整夯實(shí)，并加設(shè)50木板、掃地桿，滿鋪腳手板，并用12#鉛絲栓牢，不得有探頭板，頂部加設(shè)雙層防護(hù)欄桿。承臺(tái)施工搭設(shè)雙排操作架，腳手架立桿離基礎(chǔ)邊300mm左右，立桿縱向間距1.5m，水平間距1.5m，步距1.8m，小橫桿間距1.2m。外側(cè)加設(shè)剪刀撐和斜拉撐。剪刀撐不得大于45度。在承臺(tái)內(nèi)的立桿下加Φ32鋼筋支撐，頂部焊L=100mm鋼筋頭，高出混凝土面100mm。搭設(shè)方法見附圖2。4.2.5鋼筋工程鋼筋采用集中配制，現(xiàn)場(chǎng)綁扎，鋼筋接頭采用閃光對(duì)焊。綁扎鋼筋前先在墊層上彈出基礎(chǔ)軸線、柱邊線軸線、板墻及四角并用紅油漆標(biāo)明。在基礎(chǔ)邊線內(nèi)畫出底板鋼筋的位置，擺放并綁扎底板鋼筋。柱鋼筋、板墻和底板鋼筋綁扎在一起，在基礎(chǔ)頂部柱鋼筋用鋼管扣件框住并找準(zhǔn)位置綁扎在鋼管框上，鋼管框和模板加固鋼管連在一起，形成一個(gè)整體。鋼筋綁扎時(shí)先綁扎底板受力主筋，然后安裝模板支架（見模板工程），最后綁扎上部附加鋼筋。鋼筋保護(hù)層用1：2水泥砂漿制作，基礎(chǔ)底保護(hù)層100mm，側(cè)面及頂面為35mm，柱和拉梁保護(hù)層為35mm，剪力墻保護(hù)層為25mm。在墊塊上設(shè)置22#鉛絲綁扎在柱主筋上，呈梅花形綁扎@1000mm。4.2.6模板工程基礎(chǔ)及柱采用竹膠模板，模板加固基礎(chǔ)用鋼管圍檁和M12對(duì)拉螺栓桿加固@750×600.詳見附圖3。上層臺(tái)階懸空模板用Φ20鋼筋支架架設(shè)，間距1.5m設(shè)置一道。在基礎(chǔ)四周打入鋼管地錨用鋼管斜撐加固，使整個(gè)基礎(chǔ)成為一個(gè)整體。模板支設(shè)必須涂刷隔離劑，拆模要按照先支后拆，先支后拆的順序進(jìn)行，由高到低自上而下拆，拆除時(shí)嚴(yán)禁猛撬、猛砸，破壞砼棱角和表面。4.2.7砼工程4.2.7.1混凝土由攪拌站集中供應(yīng),罐車運(yùn)送,泵車布料,混凝土攪拌時(shí)嚴(yán)格按試驗(yàn)室配合比進(jìn)行試配,計(jì)量器具必須經(jīng)過驗(yàn)定,計(jì)量要準(zhǔn)確.混凝土澆灌采用全面分層法,拉梁及板墻采用斜面分層法.混凝土澆注一次成型,施工縫留在承臺(tái)與短柱交接處.暫留K5軸CT-4a不施工,以便泵車進(jìn)入基坑內(nèi)澆注混凝土,待其他承臺(tái)施工完畢后最后施工此承臺(tái).混凝土振搗采用插入式振搗器,插點(diǎn)間距不得大于500mm,混凝土分層厚度不得大于300mm,承臺(tái)基礎(chǔ)澆注時(shí)要嚴(yán)格控制初凝時(shí)間,第一臺(tái)階澆注后初凝以前必須澆注第二階,不得留施工縫.振搗上一層砼時(shí)要插入下一層砼5cm左右，振搗棒要快插慢拔，插點(diǎn)均勻，每次振搗到砼不再下沉，表面不再出現(xiàn)氣泡，泛出灰漿為止。基礎(chǔ)柱及剪力墻澆筑時(shí)，下方先澆筑5～10cm同配比的水泥砂漿，以防止?fàn)€根。振搗時(shí)振搗棒嚴(yán)禁觸及鋼筋模板。為了防止砼表面出現(xiàn)裂縫，應(yīng)加強(qiáng)二次振搗?；炷帘砻嬗媚灸ㄗ哟昶健簩?shí)、拉毛。4.2.7.2冬季混凝土施工要求①砼拌合物的出機(jī)溫度不宜低于10°C，混凝土入模溫度不得低于②為了減少凍害，應(yīng)將配合比中的用水量降低至最低限度。③冬期施工要及時(shí)掌握氣候變化情況，項(xiàng)目工程部、土建試驗(yàn)室應(yīng)經(jīng)常與氣象部門取得聯(lián)系，并及時(shí)將氣候的變化情況通知各專業(yè)分公司工程部，分公司工程部應(yīng)及時(shí)將天氣的變化情況通知主管生產(chǎn)經(jīng)理及各項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，便于盡快采取有效措施?；炷翝仓螅炷林車靡粚铀芰喜家粚用薇桓采w，同時(shí)做好測(cè)溫工作，發(fā)現(xiàn)混凝土溫度下降過快或遇寒流襲擊，應(yīng)立即采取加強(qiáng)保溫層措施。冬季施工應(yīng)配備棉被應(yīng)急，遇強(qiáng)冷天氣應(yīng)及時(shí)加蓋棉被。砼試件的留置除按正常溫度施工留置外，應(yīng)當(dāng)增設(shè)不少于兩組與結(jié)構(gòu)同條件養(yǎng)護(hù)的試件，分別用于檢驗(yàn)受凍前的砼強(qiáng)度和轉(zhuǎn)入常溫養(yǎng)護(hù)28d的砼強(qiáng)度。④模板和保溫層應(yīng)在混凝土冷卻到5℃后方可拆除。當(dāng)混凝土與外界的溫差大于20℃時(shí)，拆模后的混凝土表面應(yīng)臨時(shí)覆蓋，使其緩慢冷卻。⑤冬季施工期間，施工單位應(yīng)與氣象部門保持密切聯(lián)系，隨時(shí)掌握天氣預(yù)報(bào)、寒潮、大風(fēng)警報(bào)，以便及時(shí)采取防護(hù)措施。eq\o\ac(○,6)冬季施工為保證混凝土入模溫度,在混凝土攪拌站設(shè)專用水箱,采用蒸汽加熱拌合水的方法提高混凝土的溫度,骨料不加熱,水溫不得大于80℃.拌合水的溫度應(yīng)隨時(shí)檢查，根據(jù)混凝土的出機(jī)溫度適當(dāng)進(jìn)行水溫的調(diào)整?；炷吝\(yùn)輸采用罐車,冬季為保證熱量散失,在罐體外包裹專用保溫棉套。在混凝土澆注過程中盡量加快澆注速度,以免熱量散失。4.2.7.3大體積混凝土施工本工程柱基和基礎(chǔ)柱均為大體積混凝土，為了減小大體積混凝土溫度裂縫的產(chǎn)生，必須采取如下措施：①摻粉煤灰（粉煤灰為Ⅱ級(jí)），宜減少水泥用量。②摻緩凝劑砼初凝時(shí)間為4～6小時(shí)。③選擇合宜的砂石級(jí)配盡量減少水泥用量，使水化熱相應(yīng)降低，砂含泥量控制在2%以內(nèi)，石子選用5～40mm，含泥及石粉量小于1%。④盡量降低每立方米混凝土的用水量。⑤降低混凝土的入模溫度。⑥加強(qiáng)保溫（一層塑料布、一層棉被）。⑦水泥選用32.5礦渣水泥。⑧延長混凝土的拆模時(shí)間。大體積選CT-6和CT-8基礎(chǔ)進(jìn)行測(cè)溫，每個(gè)基礎(chǔ)設(shè)一處，分上、中、下三個(gè)測(cè)點(diǎn)，測(cè)溫管使用4分管制作，測(cè)溫管均露出混凝土面20mm，測(cè)溫管布置見附圖4。混凝土澆注后每個(gè)2小時(shí)測(cè)溫一次，并做好測(cè)溫記錄，當(dāng)內(nèi)部與表面溫差大于25℃時(shí)應(yīng)增加棉被的厚度，以減少溫差?；炷林侄螡仓?，第一次澆筑至-1.7m，第二次澆筑至-0.6m，兩次澆筑至界面應(yīng)鑿毛清洗干凈，并充分濕潤，待混凝土強(qiáng)度達(dá)到70%以上，固定支架方可就位。由于鍋爐基礎(chǔ)柱斷面較大，澆筑混凝土?xí)r應(yīng)循環(huán)澆筑，每次澆筑時(shí)，不能一次澆筑而成，應(yīng)分層澆筑。保溫層厚度計(jì)算：δ=0.5hλχ(T2-Tq)Kb/λ(Tmax-T2)其中h=3500mm,λχ—所選保溫材料導(dǎo)熱系數(shù)[W/（mk）]取0.14T2-Tq—砼表面與大氣溫差，取10℃Tmax-T2砼中與表面溫差，取25Kb—傳熱系數(shù)修正值，取1.3λ—砼導(dǎo)熱系數(shù)，取2.33W/(mk)∴δ=0.5×3.5×0.14×10×1.3/25×2.33=0.055=55mm.因此由計(jì)算得出保溫層為一層塑料布，58mm厚棉被保溫養(yǎng)護(hù)。4.2.8土方回填考慮到鍋爐０m以下土方回填為冬季施工，故必須嚴(yán)格按照冬季施工措施和規(guī)范要求施工。填方前清除基底上的冰雪和材料；回填可采用含有凍土塊的土料，但凍塊粒徑不得大于15cm，含量不得超過15%，且均勻分布；每層鋪土厚度比常溫施工時(shí)減少20～25%?；靥钋霸诨A(chǔ)上做出回填厚度標(biāo)志，回填土質(zhì)符合圖紙要求。初步整平后碾壓或打夯，分層回填分層試驗(yàn)，壓實(shí)系數(shù)按設(shè)計(jì)院要求執(zhí)行，由實(shí)驗(yàn)室取樣合格后方可回填下一層，回填土的分層厚度機(jī)械回填虛鋪300mm，蛙式打夯機(jī)回填虛鋪250mm，人工回填200mm。施工人員及質(zhì)檢人員需加強(qiáng)回填土的過程控制。分層回填，分層試驗(yàn)，經(jīng)試驗(yàn)合格后方可進(jìn)行下一層土方的回填。冬季進(jìn)行土方回填作業(yè)是要嚴(yán)防虛土受凍，土方攤開后應(yīng)立即進(jìn)行碾壓，夜間停止作業(yè)時(shí)應(yīng)保證最后一層是虛土，并在虛土上滿鋪2層麻袋進(jìn)行保溫?；靥钔聊雺夯虼蚝话匆欢ǚ较蜻M(jìn)行，一夯壓半夯，分層夯實(shí)、夯夯相連，每遍縱橫交錯(cuò)，每層接縫作成臺(tái)階形，夯跡重疊0.5～1m，上下層接縫錯(cuò)開1m以上?；A(chǔ)四周用跳夯夯實(shí)。4.2.9成品保護(hù)措施為保持混凝土柱棱角完整，鍋爐基礎(chǔ)柱拆模后用藍(lán)色塑料布包裹兩層，再用∠50×5保護(hù)，中間間隔500mm用-50×55.作業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)5.1作業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鋼筋：模板：骨架長≤10mm軸線位移≤5mm箍筋間距±20mm基礎(chǔ)截面尺寸+2～-5mm主筋間距±10mm標(biāo)高偏差±5mm主筋排距±5mm模板垂直度≤2mm主筋保護(hù)層±5mm表面平整度≤2mm砼：長度偏差±5mm截面尺寸±5mm標(biāo)高偏差0～-10mm表面平整度≤5mm5.2作業(yè)操作質(zhì)量要點(diǎn)及保證措施5.2.1材料及半成品進(jìn)廠必須有合格證及檢驗(yàn)報(bào)告。必檢項(xiàng)目復(fù)檢合格后，報(bào)監(jiān)理驗(yàn)收合格方可進(jìn)行。5.2.2分項(xiàng)工程質(zhì)量檢驗(yàn)執(zhí)行四級(jí)驗(yàn)收制度，即班組自檢、專業(yè)公公司復(fù)檢、項(xiàng)目部專業(yè)檢驗(yàn)與建設(shè)單位和監(jiān)理共同檢驗(yàn)。上一道工序驗(yàn)收合格后方可進(jìn)行下一道工序施工。5.2.3鋼筋對(duì)焊需持證上崗，對(duì)焊前需作班前件、合格后才能成品對(duì)焊。5.2.4鋼筋配制前先調(diào)直，綁扎前核對(duì)鋼筋品種數(shù)量，準(zhǔn)確無誤后才可綁扎。5.2.5模板支設(shè)前先整平打磨，刷隔離劑，有翹曲的模板嚴(yán)禁使用，使用木模須刨光。5.2.6模板加固牢固自成一體，連接件齊全，對(duì)拉螺桿、螺帽擰緊，澆灌砼時(shí)設(shè)專人看護(hù)模板，發(fā)現(xiàn)異常立即采取加固措施。5.2.7砼連續(xù)澆筑，中途停歇不超過2小時(shí)，砼要振搗密實(shí)，無漏振，表面壓光。6.作業(yè)的安全措施6.1本項(xiàng)目作業(yè)一般安全措施6.1.1進(jìn)入現(xiàn)場(chǎng)人員必須經(jīng)三級(jí)安全教育考試合格后才準(zhǔn)上崗。6.1.2施工現(xiàn)場(chǎng)作業(yè)人員必須統(tǒng)一著裝，正確佩戴安全帽，高處作業(yè)必須系好安全帶。6.1.3機(jī)械操作必須持證上崗，所有機(jī)械運(yùn)轉(zhuǎn)良好，不得帶病作業(yè)，現(xiàn)場(chǎng)機(jī)動(dòng)車輛時(shí)速限制在5公里/小時(shí)以內(nèi)。6.1.4腳手架由專業(yè)架子工搭設(shè)，驗(yàn)收合格后方可使用，施工過程中嚴(yán)禁任何人私自拆搭腳手架，腳手