分子生物學(xué)生物信息的傳遞上

分子生物學(xué)生物信息的傳遞上第1頁(yè)/共162頁(yè)基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄(transcription)和翻譯(translation)兩個(gè)階段。轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同(U替換T)的RNA單鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的核心步驟；第2頁(yè)/共162頁(yè)翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的最終目的。第3頁(yè)/共162頁(yè)與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈(codingstrand)或稱有意義鏈(sensestrand)；另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈(templatestrand)或稱反義鏈(antisensestrand)。第4頁(yè)/共162頁(yè)貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉(zhuǎn)錄生成RNA，才能得到表達(dá)。RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，它們既擔(dān)負(fù)著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。第5頁(yè)/共162頁(yè)RNA分子來(lái)自DNA。儲(chǔ)存于DNA雙鏈中的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則被轉(zhuǎn)化成為單鏈RNA分子。第6頁(yè)/共162頁(yè)生物體內(nèi)共有3種RNA：１、信使RNA(messengerRNA，mRNA)－編碼特定蛋白質(zhì)序列；2、轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA，tRNA)－特異性解讀mRNA中的遺傳信息、將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸并將其加入多肽鏈中；3、核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)直接參與核糖體中蛋白質(zhì)合成。

第7頁(yè)/共162頁(yè)3．1RNA的轉(zhuǎn)錄3·1·1轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程無(wú)論是原核還是真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程都包括:模板識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過(guò)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。第8頁(yè)/共162頁(yè)第9頁(yè)/共162頁(yè)在原核生物中，模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程。第10頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄起始前，啟動(dòng)子附近的DNA雙鍵分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)。轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。

第11頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核酸苷短鏈前是通過(guò)啟動(dòng)子階段，此時(shí)RNA聚合酶一直處于啟動(dòng)子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來(lái)并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開始。第12頁(yè)/共162頁(yè)一旦RNA聚合酶成功地合成9個(gè)以上核苷酸并離開啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)人正常的延伸階段。所以，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間代表一個(gè)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。一般說(shuō)來(lái)，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。第13頁(yè)/共162頁(yè)RNA聚合酶離開啟動(dòng)子，沿DNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過(guò)程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。隨著RNA聚合酶的移動(dòng)，DNA雙螺旋持續(xù)解開且新生RNA鏈的3’末端不斷延伸，在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。在解鏈區(qū)的后面DNA模板與非模板鏈重新結(jié)合成為雙螺旋。第14頁(yè)/共162頁(yè)當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來(lái)，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。第15頁(yè)/共162頁(yè)真核生物RNA聚合酶需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(輔助蛋白質(zhì))按特定順序結(jié)合于啟動(dòng)子上并形成復(fù)雜的前起始復(fù)合物。轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度基本相等。第16頁(yè)/共162頁(yè)3·1·2轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分3·1·2·1RNA聚合酶以DNA序列為模板的RNA聚合酶主要以雙鏈DNA為模板，以4種ＮＴＰ為活性前體，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，不需任何引物，催化生成與DNA模板鏈互補(bǔ)的RNA。第17頁(yè)/共162頁(yè)3·1·2轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分3·1·2·1RNA聚合酶RNA或RNA-DNA雙鏈雜合體不能作為模板。第18頁(yè)/共162頁(yè)大腸桿菌RNA聚合酶的主要

成分與功能大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌RNA聚合酶由2個(gè)α亞基、一個(gè)β亞基、一個(gè)β’亞基和一個(gè)ω亞基組成，稱為核心酶。加上一個(gè)σ亞基后則成為聚合酶全酶(holoenzyme)。第19頁(yè)/共162頁(yè)第20頁(yè)/共162頁(yè)由β和β’亞基組成了聚合酶的催化中心。β亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。α亞基與核心酶的組裝及啟動(dòng)子識(shí)別有關(guān)，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用。第21頁(yè)/共162頁(yè)σ因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它使酶專一性識(shí)別模板上的啟動(dòng)子。σ因子可以極大地提高RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的親和力，同時(shí)使RNA聚合酶與模板DNA上非特異性位點(diǎn)的結(jié)合降低。第22頁(yè)/共162頁(yè)σ因子大大增加聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力，并降低酶對(duì)非專一位點(diǎn)的親和力，使酶專一性識(shí)別模板上的啟動(dòng)子。第23頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄的起始是單個(gè)核苷酸與開鏈啟動(dòng)子－酶復(fù)合物相結(jié)合構(gòu)成新生RNA的5’端，再以磷酸二酯鍵的形式與第二個(gè)核苷酸相結(jié)合，起始的終止反映在σ因子的釋放。第24頁(yè)/共162頁(yè)當(dāng)新生RNA鏈達(dá)到6～9個(gè)核苷酸時(shí)，能形成穩(wěn)定的酶－DNA－RNA三元復(fù)合物，并釋放σ因子，轉(zhuǎn)錄進(jìn)入延伸期。第25頁(yè)/共162頁(yè)當(dāng)聚合酶按5’→3’方向延伸RNA鏈時(shí)，解旋的DNA區(qū)域也隨之移動(dòng)。聚合酶可以橫跨約40bp，而解旋的DNA區(qū)域大約是17bp。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA鏈上，并形成DNA-RNA雜合體。隨著聚合酶在模板上的運(yùn)動(dòng)，靠近3'端的DNA不斷解旋，同時(shí)在5'端重新形成DNA雙鏈，將RNA鏈擠出DNA-RNA雜合體。RNA的3'端大約有20～30個(gè)核苷酸與DNA和聚合酶相結(jié)合。第26頁(yè)/共162頁(yè)第27頁(yè)/共162頁(yè)真核生物中共有3類RNA聚合酶，它們?cè)诩?xì)胞核中的位置不同，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的基因不同。不同生物3類聚合酶的亞基種類和大小存在兩條普遍遵循的原則:一是聚合酶中有兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)l×105的大亞基；二是同種生物3類聚合酶有"共享"小亞基的傾向，即有幾個(gè)小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的。第28頁(yè)/共162頁(yè)第29頁(yè)/共162頁(yè)真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶。線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性。第30頁(yè)/共162頁(yè)葉綠體RNA聚合酶比較大，結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌中的聚合酶相似，由多個(gè)亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼。

第31頁(yè)/共162頁(yè)3·1·2·2轉(zhuǎn)錄復(fù)合物

啟動(dòng)子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別，聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closedcomplex）。第32頁(yè)/共162頁(yè)3·1·2·2轉(zhuǎn)錄復(fù)合物伴隨著DNA構(gòu)象上的重大變化，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開放復(fù)合物(opencomplex)，聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開。第33頁(yè)/共162頁(yè)

強(qiáng)啟動(dòng)子→從封閉復(fù)合物到開放復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應(yīng)。開放復(fù)合物與最初兩個(gè)NTP相結(jié)合并在這兩個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后→(RNA聚合酶、DNA和新生RNA)三元復(fù)合物。第34頁(yè)/共162頁(yè)真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的分子量很大：RNA聚合酶、7種輔助因子，輔助因子又包含多個(gè)亞基。第35頁(yè)/共162頁(yè)第36頁(yè)/共162頁(yè)三元復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑，一是合成并釋放2～9個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物－－流產(chǎn)式起始.第37頁(yè)/共162頁(yè)二是盡快釋放σ亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過(guò)上游啟動(dòng)子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。第38頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄的真實(shí)性取決于有特異的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始后按照堿基互補(bǔ)原則準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)錄模板DNA序列及具有特異的終止部位。第39頁(yè)/共162頁(yè)RNA的合成是在模板DNA的啟動(dòng)子位點(diǎn)上起始的，而這個(gè)任務(wù)是靠σ因子來(lái)完成的。RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位點(diǎn)。核心酶的產(chǎn)物是不均一的，因?yàn)樗鼪](méi)有固定的起始位點(diǎn)，而且DNA兩條鏈都可作為模板。第40頁(yè)/共162頁(yè)只有帶σ因子的全酶才能專一地與DNA上的啟動(dòng)子結(jié)合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。第41頁(yè)/共162頁(yè)σ因子的作用只是起始而已，一旦轉(zhuǎn)錄開始，它就脫離了起始復(fù)合物，而由核心酶負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。第42頁(yè)/共162頁(yè)因此，聚合酶全酶的作用是啟動(dòng)子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。第43頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物是轉(zhuǎn)錄循環(huán)中一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)。與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物相比，延伸復(fù)合物極為穩(wěn)定，可以長(zhǎng)時(shí)間地與DNA模板相結(jié)合而不解離。第44頁(yè)/共162頁(yè)只有在它遇到轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)時(shí)，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA－DNA雜合物解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并導(dǎo)致聚合酶本身從模板DNA上掉下來(lái)。第45頁(yè)/共162頁(yè)3·2啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始大腸桿菌RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用主要包括啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別、酶與啟動(dòng)子的結(jié)合及σ因子的結(jié)合與解離。第46頁(yè)/共162頁(yè)3·2·1啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。第47頁(yè)/共162頁(yè)3·2·1啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)基因的特異性轉(zhuǎn)錄取決于酶與啟動(dòng)子能否有效地形成二元復(fù)合物，所以，RNA聚合酶如何有效地找到啟動(dòng)子并與之相結(jié)合是轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中首要解決的問(wèn)題。第48頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問(wèn)題是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)影響了它與RNA聚合酶的親和力，從而影響了基因表達(dá)的水平。第49頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄單元(transcriptionunit)是一段從啟動(dòng)子至終止子(terminator)的DNA序列。RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)開始沿模板前進(jìn)到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。在細(xì)菌中，一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元可以是一個(gè)基因，也可以是幾個(gè)基因。第50頁(yè)/共162頁(yè)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是指與新生RNA鏈第一個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基，研究證實(shí)通常為一個(gè)嘌呤。常把起點(diǎn)前面，即5'末端的序列稱為上游(upstream)，而把其后面即3’末端的序列稱為下游(downstream)。第51頁(yè)/共162頁(yè)啟動(dòng)子區(qū)是RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)有什么結(jié)構(gòu)特點(diǎn)呢?第52頁(yè)/共162頁(yè)P(yáng)ribnow設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，他把RNA聚合酶全酶與模板DNA結(jié)合后，用DNaseI水解DNA，然后用酚抽提，沉淀純化DNA后得到一個(gè)被RNA聚合酶保護(hù)的DNA片段，約有41~44個(gè)核苷酸對(duì)。第53頁(yè)/共162頁(yè)第54頁(yè)/共162頁(yè)他分析發(fā)現(xiàn)，在被保護(hù)區(qū)內(nèi)有一個(gè)由5個(gè)核苷酸組成的共同序列，是RNA聚合酶的緊密結(jié)合點(diǎn)，現(xiàn)在稱為Pribnow區(qū)(Pribnowbox)，這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱－10區(qū)。第55頁(yè)/共162頁(yè)科學(xué)家在啟動(dòng)子的－35bp附近找到了另一段共同序列:TTGACA。經(jīng)過(guò)數(shù)年的努力，確證絕大部分啟動(dòng)子都存在這兩段共同序列，即－10bp處的TATA區(qū)和－35bp處的TTGACA區(qū)。第56頁(yè)/共162頁(yè)-10位的TATA區(qū)和-35位的TGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與σ因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。

第57頁(yè)/共162頁(yè)第58頁(yè)/共162頁(yè)在真核生物基因中，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－25～－30bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)。第59頁(yè)/共162頁(yè)另外，在起始位點(diǎn)上游-70～-78bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與原核生物中-35bp區(qū)相對(duì)應(yīng)的序列，稱為CAAT區(qū)(CAATbox)。第60頁(yè)/共162頁(yè)3.2.2啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別RNA聚合酶是通過(guò)氫鍵互補(bǔ)的方式識(shí)別啟動(dòng)子的。堿基中的某些基團(tuán)是氫鍵受體和氫鍵供體處于DNA雙螺旋的大溝或小溝內(nèi)，因此都具有特定的方位.第61頁(yè)/共162頁(yè)3.2.2啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵受體與供體，當(dāng)它們與啟動(dòng)子中對(duì)應(yīng)的分子在一定距離內(nèi)互補(bǔ)時(shí)，就形成氫鍵，相互結(jié)合。第62頁(yè)/共162頁(yè)3.2.3酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合RNA聚合酶＋閉合雙鏈DNA→二元閉合復(fù)合物→二元開鏈復(fù)合物。酶與啟動(dòng)子結(jié)合的主要區(qū)域在解鏈區(qū)(-9～+13)上游。第63頁(yè)/共162頁(yè)RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。DNA開鏈?zhǔn)前凑誅NA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。第64頁(yè)/共162頁(yè)第65頁(yè)/共162頁(yè)3.2.4-10區(qū)與-35區(qū)的最佳間距在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間距離大約是16～19bp，小于15bp或大于20bp都會(huì)降低啟動(dòng)子活性，并基因的表達(dá)水平。第66頁(yè)/共162頁(yè)因?yàn)樵鰷pbp，-35區(qū)相對(duì)于-10區(qū)旋轉(zhuǎn)（增減一個(gè)bp會(huì)使兩者之間的夾角發(fā)生360的變化）產(chǎn)生超螺旋結(jié)構(gòu)的改變。第67頁(yè)/共162頁(yè)在細(xì)菌中常見兩種啟動(dòng)子突變，一種叫下降突變(downmutation)，如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會(huì)大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平。第68頁(yè)/共162頁(yè)另一類為上升突變(upmutation)，即增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性，提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。

第69頁(yè)/共162頁(yè)3·2·5增強(qiáng)子及其功能增強(qiáng)子是在SV40轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約200bp處有兩段72bp長(zhǎng)的重復(fù)序列。第70頁(yè)/共162頁(yè)3·2·5增強(qiáng)子及其功能增強(qiáng)子非啟動(dòng)子，但能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始。除去增強(qiáng)子會(huì)降低基因轉(zhuǎn)錄水平。保留其一或?qū)⑵洳逯罝NA分子的任何部位，可保持基因的正常轉(zhuǎn)錄。第71頁(yè)/共162頁(yè)這種能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子(enhancer)。后來(lái)在許多基因的啟動(dòng)區(qū)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子的存在。第72頁(yè)/共162頁(yè)增強(qiáng)子可能通過(guò)模板結(jié)構(gòu)的改變，使得RNA聚合酶易與模板DNA相結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。

第73頁(yè)/共162頁(yè)3.2.6真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響啟動(dòng)子是確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列。1979年美國(guó)科學(xué)家Goldberg注意到真核生物由RNA聚合酶II催化轉(zhuǎn)錄的DNA序列5'上游區(qū)有一段與原核生物Pribnow區(qū)相似的富含TA的保守序列。由于該序列前4個(gè)堿基為TATA，所以又稱為TATA區(qū)(TATAbox)。

第74頁(yè)/共162頁(yè)3.2.6真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響啟動(dòng)子是確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列

(TATAbox)。

第75頁(yè)/共162頁(yè)真核啟動(dòng)子具有共同結(jié)構(gòu)模式：

1）真核基因的啟動(dòng)子在-25～-35區(qū)含有TATA序列；

2）在-70～-80區(qū)含有CCAAT序列(CAATbox)；

3）在-80～-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列(GCbox)。第76頁(yè)/共162頁(yè)TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動(dòng)子元件(upstreampromoterelement，UPE)或稱上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。第77頁(yè)/共162頁(yè)第78頁(yè)/共162頁(yè)原核基因啟動(dòng)區(qū)范圍較小，TATAAT(Pribnow區(qū))的中心位于-10，上游只有TTGACA區(qū)(-35區(qū))作為RNA聚合酶的主要結(jié)合位點(diǎn)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。第79頁(yè)/共162頁(yè)真核基因的調(diào)控區(qū)較大，TATAA/TA區(qū)位于-20～-30，-40～-110區(qū)為上游激活區(qū)，CAAT區(qū)(-70～-78區(qū))，大多基因還擁有GC區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)。第80頁(yè)/共162頁(yè)TATA區(qū)主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地（特異位點(diǎn)）起始，若除去TATA區(qū)或進(jìn)行堿基突變，RNA產(chǎn)物起始點(diǎn)不固定。CAAT區(qū)或GC區(qū)是決定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)率高低的。第81頁(yè)/共162頁(yè)CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定，CAAT區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大。在TATA區(qū)和相鄰的UPE區(qū)之間插入核苷酸也會(huì)使轉(zhuǎn)錄減弱。第82頁(yè)/共162頁(yè)盡管這3種啟動(dòng)子區(qū)序列都有著重要功能，但并不是每個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)都包含這3種序列。第83頁(yè)/共162頁(yè)真核細(xì)胞中存在著大量特異性或組成型表達(dá)的、能夠與不同基因啟動(dòng)子區(qū)UPE相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。第84頁(yè)/共162頁(yè)基因轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。第85頁(yè)/共162頁(yè)3.3原核與真核生物mRNA的特征比較mRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)占總RNA的2%左右(tRNA占16%，而rRNA則占80%以上)。第86頁(yè)/共162頁(yè)3.3原核與真核生物mRNA的特征比較科學(xué)家很早就猜想生物細(xì)胞內(nèi)存在能將遺傳信息從DNA上轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子上的信使(或稱模板)。但由于mRNA在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短，直到20世紀(jì)70年代初才首次將這一重要物質(zhì)從細(xì)胞中分離出來(lái)。第87頁(yè)/共162頁(yè)現(xiàn)已清楚，許多基因的mRNA在體內(nèi)還是相當(dāng)穩(wěn)定的，半衰期從幾個(gè)小時(shí)到幾天不等。目前，人們己能從幾乎所有生物體內(nèi)分離純化編碼任何蛋白質(zhì)的mRNA。第88頁(yè)/共162頁(yè)mRNA在所有細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過(guò)密碼三聯(lián)子翻譯生成蛋白質(zhì)，但其生物合成的具體過(guò)程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核細(xì)胞內(nèi)是不同的。第89頁(yè)/共162頁(yè)真核細(xì)胞只有成熟的mRNA、相對(duì)分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學(xué)修飾的mRNA才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細(xì)胞mRNA的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時(shí)間范疇內(nèi)。第90頁(yè)/共162頁(yè)原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞空間里，而且這兩個(gè)過(guò)程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時(shí)就被引發(fā)。第91頁(yè)/共162頁(yè)一個(gè)原核細(xì)胞的mRNA(包括病毒)有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽，而一個(gè)真核細(xì)胞的mRNA最多只能編碼一個(gè)多肽。第92頁(yè)/共162頁(yè)原核生物常以AUG作為起始密碼子，有時(shí)GUG或UUG也作為起始密碼子；真核生物幾乎永遠(yuǎn)以AUG作為起始密碼子。第93頁(yè)/共162頁(yè)3·3·1原核生物mRNA的特征1·原核生物mRNA的半衰期短細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯是緊密相聯(lián)的，基因轉(zhuǎn)錄一旦開始，核糖體就結(jié)合到新生mRNA鏈的5’端，啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成，而此時(shí)該mRNA的3’端還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有轉(zhuǎn)錄完全。第94頁(yè)/共162頁(yè)3·3·1原核生物mRNA的特征1·原核生物mRNA的半衰期短在電子顯微鏡下，我們可以看到一連串核糖體緊緊跟在RNA聚合酶后面。第95頁(yè)/共162頁(yè)絕大多數(shù)細(xì)菌mRNA的半衰期很短，mRNA降解緊隨著蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程發(fā)生。轉(zhuǎn)錄開始1min后，降解就開始了，當(dāng)mRNA的5'端開始降解時(shí)，其3'端部分仍在合成或被翻譯。mRNA的降解速度大概是轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半。第96頁(yè)/共162頁(yè)因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)錄和多鏈肽延伸的速度基本相同，所以細(xì)胞內(nèi)某一基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的多少?zèng)Q定于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始效率。第97頁(yè)/共162頁(yè)以大腸桿菌色氨酸合成酶基因?yàn)槔?，平均每分鐘約有15次轉(zhuǎn)錄起始，這些mRNA鏈從生成到降解平均被翻譯10次，所以，穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞中每分鐘生成150個(gè)多肽。第98頁(yè)/共162頁(yè)2、原核生物mRNA多以多順?lè)醋哟嬖诩?xì)菌mRNA可同時(shí)編碼不同蛋白質(zhì)。編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA為多順?lè)醋觤RNA。多順?lè)醋觤RNA是一組相鄰基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,這一組基因被稱為一個(gè)操縱子。單順?lè)醋觤RNA為只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。第99頁(yè)/共162頁(yè)所有mRNA都被分成3部分

編碼區(qū)、位于AUG之前的5’端上游非編碼區(qū)以及位于終止密碼子之后不翻譯的3’端下游非編碼區(qū)。第100頁(yè)/共162頁(yè)編碼區(qū)始于起始密碼子AUG，經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼子直至終止密碼子。第101頁(yè)/共162頁(yè)對(duì)第一個(gè)順?lè)醋觼?lái)說(shuō)，一旦mRNA的5’端被合成，翻譯起始位點(diǎn)即可與核糖體相結(jié)合，而后面幾個(gè)順?lè)醋臃g的起始就會(huì)受其上游順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)的調(diào)控。第102頁(yè)/共162頁(yè)一種情況是，第一個(gè)蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板，第二個(gè)蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該蛋白起始密碼子相結(jié)合后才可能開始。第103頁(yè)/共162頁(yè)另一情況是前一個(gè)多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，小亞基不離開mRNA模板，而是迅速與游離的大亞基結(jié)合，啟動(dòng)第二個(gè)多肽的合成。第104頁(yè)/共162頁(yè)在噬菌體RNA中，一個(gè)順?lè)醋拥姆g有時(shí)完全取決于它前面順?lè)醋拥姆g，因?yàn)槭删wRNA往往形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，只有第一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)是暴露的，在這個(gè)順?lè)醋臃g產(chǎn)生多肽的過(guò)程中，核糖體的運(yùn)動(dòng)破壞了后續(xù)順?lè)醋拥亩?jí)結(jié)構(gòu)，使起始位點(diǎn)較容易與核糖體相結(jié)合形成起復(fù)合物。第105頁(yè)/共162頁(yè)第106頁(yè)/共162頁(yè)3.原核生物mRNA的5’端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3’端無(wú)或者只有較短的poly(A)結(jié)構(gòu)。

第107頁(yè)/共162頁(yè)3.3.2真核生物mRNA的特征凡是編碼功能蛋白的真核基因都通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。真核基因幾乎都是單順?lè)醋?，只包含一個(gè)蛋白質(zhì)的信息，其長(zhǎng)度在幾百到幾千個(gè)核苷酸之間。第108頁(yè)/共162頁(yè)3.3.2真核生物mRNA的特征一個(gè)完整基因包括編碼區(qū)(codingregion)，和不編碼氨基酸的5’和3’端的特異性序列。第109頁(yè)/共162頁(yè)"基因"的分子生物學(xué)定義是:產(chǎn)生一條多肽鏈的功能RNA所必需的全部DNA核苷酸序列!真核生物mRNA結(jié)構(gòu)上的最大特征是5'端的帽子及3'的poly"(A)結(jié)構(gòu)。第110頁(yè)/共162頁(yè)真核生物mRNA的5’端的"帽子"真核生物的mRNA(不包括葉綠體和線粒體)5’端都是經(jīng)過(guò)修飾的，基因轉(zhuǎn)錄一般從A起始，第一個(gè)核苷酸保留了5’端的三磷酸基團(tuán)并能通過(guò)其3'-OH位與下一個(gè)核苷酸的5’磷酸基團(tuán)形成二酯鍵，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的起始序列為pppApNpNp……第111頁(yè)/共162頁(yè)但如果在體外用核酸酶處理成熟mRNA;其5’端并不產(chǎn)生預(yù)期的核苷三磷酸，而產(chǎn)生以5’→5’三磷酸基團(tuán)相連的二核苷酸，5’終端是一個(gè)在mRNA轉(zhuǎn)錄后加上去的甲基化鳥嘌呤。第112頁(yè)/共162頁(yè)第113頁(yè)/共162頁(yè)mRNA5’端加“G”的反應(yīng)是由腺苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的，這個(gè)反應(yīng)非常迅速，很難測(cè)得5’端存在自由三磷酸基團(tuán)。即mRNA幾乎一誕生就戴上帽子的。第114頁(yè)/共162頁(yè)mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。第一個(gè)甲基出現(xiàn)在所有真核細(xì)胞的mRNA中，稱為零號(hào)帽子(cap0)。第二個(gè)核苷酸(原mRNA5’第一位)的2’-OH位上加另一個(gè)甲基。有這個(gè)甲基的結(jié)構(gòu)稱為1號(hào)帽子(cap1)，真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主。在某些生物細(xì)胞內(nèi)，mRNA鏈上的第三個(gè)核苷酸的2‘-OH位也可能被甲基化，被稱為2號(hào)帽子（cap2），占有帽mRNA總量的10%～15%。

第115頁(yè)/共162頁(yè)

帽子結(jié)構(gòu)使mRNA免遭核酸酶的破壞。當(dāng)珠蛋白mRNA5‘端的7-M-G被除去后，該mRNA分子的翻譯活性和穩(wěn)定性都明顯下降。有帽子結(jié)構(gòu)的mRNA更容易被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識(shí)別，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。mRNA5'端甲基化的帽子是翻譯所必須的。甲基化的帽子結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)合成起始信號(hào)的一部分。第116頁(yè)/共162頁(yè)多數(shù)真核生物mRNA有poly(A)尾巴除組蛋白基因外，真核生物mRNA的3’末端都有poly(A)序列，其長(zhǎng)度因mRNA種類不同而變化，一般為40～200個(gè)。poly(A)序列是在轉(zhuǎn)錄后加上去的，是在細(xì)胞核中的不均一核RNA階段加上的。

第117頁(yè)/共162頁(yè)真核基因的3’末端poly(A)起始位點(diǎn)上游15～30bp處有一段保守序列AAUAAA，這對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確切割及加poly(A)是必需的。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)將AAUAAA的基因序列AATAAA變?yōu)锳AGAAA，發(fā)現(xiàn)mRNA的剪接加工受阻，沒(méi)有功能性mRNA產(chǎn)生。第118頁(yè)/共162頁(yè)RNA聚合酶Ⅱ是真核細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄RNA的酶。RNA聚合酶Ⅱ在poly(A)起始位點(diǎn)不終止而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，大多基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擁有該位點(diǎn)下游0·5～2kb核苷酸序列。加poly(A)需內(nèi)切酶切開mRNA3’端的特定部位，然后由poly(A)合成酶催化多聚腺苷酸的反應(yīng)。

第119頁(yè)/共162頁(yè)第120頁(yè)/共162頁(yè)poly(A)為mRNA進(jìn)細(xì)胞質(zhì)所必需，可提高mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。mRNA剛進(jìn)胞質(zhì)時(shí)其poly(A)較長(zhǎng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，poly(A)逐漸變短消失，mRNA開始降解。第121頁(yè)/共162頁(yè)真核生物mRNA大都具poly(A)尾巴，這一特性已被廣泛應(yīng)用于分子克隆。常用寡聚dT片段與mRNA上的poly(A)相配對(duì)，作為反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA鏈的引物。第122頁(yè)/共162頁(yè)但細(xì)胞中還有1/3mRNA無(wú)poly(A)的，mRNA帶有poly(A)的稱為poly(A)+，而沒(méi)poly(A)的稱為poly(A)－。約1/3的poly(A)－mRNA編碼了不同形式的組蛋白，其余2/3的poly(A)－mRNA帶有與poly(A)+組分相同的遺傳信息。第123頁(yè)/共162頁(yè)3.4終止RNA聚合酶啟始轉(zhuǎn)錄后沿模板5‘→3’方向移動(dòng)并合成RNA鏈，直到碰上終止信號(hào)時(shí)才與模板脫離并釋放新生RNA鏈。發(fā)生終止時(shí)，RNA-DNA雜合體的氫鍵被破壞，模板DNA鏈與有義鏈重新組合成DNA雙鏈。第124頁(yè)/共162頁(yè)3·4·1由基因序列決定的終止終止位點(diǎn)上游存在富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。終止位點(diǎn)前有一段4～8個(gè)A的序列，故其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端為寡聚U，該結(jié)構(gòu)決定轉(zhuǎn)錄的終止。第125頁(yè)/共162頁(yè)當(dāng)RNA出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5‘端的正常結(jié)構(gòu)。第126頁(yè)/共162頁(yè)寡聚U的存在使雜合鏈的3’端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rU·dA區(qū)域。兩者共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來(lái)。第127頁(yè)/共162頁(yè)第128頁(yè)/共162頁(yè)終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U的長(zhǎng)短有關(guān)，隨發(fā)卡式結(jié)構(gòu)(至少6bp)和寡聚U序列(至少4個(gè)U)長(zhǎng)度的增加，終止效率越高。第129頁(yè)/共162頁(yè)3.4.2依賴于ρ因子的終止ρ因子是NTP酶，它催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)而終止轉(zhuǎn)錄。依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)DNA序列無(wú)共性，ρ因子不能識(shí)別終止位點(diǎn)。第130頁(yè)/共162頁(yè)ρ因子附著在新生的RNA鏈上，沿5’→3’朝RNA聚合酶移動(dòng)，達(dá)RNA的3‘-OH端后取代終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放出來(lái)，同時(shí)釋放mRNA，完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。第131頁(yè)/共162頁(yè)第132頁(yè)/共162頁(yè)3·5內(nèi)含子的剪接、編輯

及化學(xué)修飾3·5·lRNA中的內(nèi)含子真核斷裂基因表達(dá)伴隨著RNA的剪接過(guò)程,從mRNA前體中切除內(nèi)含子(intron)的非編碼區(qū)，并使外顯子(exon)的編碼區(qū)拼接成成熟mRNA。第133頁(yè)/共162頁(yè)第134頁(yè)/共162頁(yè)真核基因大多是斷裂的，即一個(gè)基因可由多個(gè)內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。內(nèi)含子在真核基因中所占的比例很高，可超過(guò)99%。第135頁(yè)/共162頁(yè)第136頁(yè)/共162頁(yè)核不均一RNA(hnRNA)→5‘加“帽”和3’加尾→剪接→可讀框(openreadingframe，ORF)→核孔→細(xì)胞質(zhì)→蛋白質(zhì)合成的模板。第137頁(yè)/共162頁(yè)第138頁(yè)/共162頁(yè)不同生物細(xì)胞內(nèi)含子的邊界處存在相似的核苷酸序列。GU-AG和AU-AC分別是不同內(nèi)含子的5’和3’邊界序列。第139頁(yè)/共162頁(yè)內(nèi)含子內(nèi)部的部分序列都有可能參與內(nèi)含子的剪接。第140頁(yè)/共162頁(yè)第141頁(yè)/共162頁(yè)3·5·2RNA的剪接核內(nèi)RNA(