臨床分子診斷學(xué)課件：第四章 核酸與蛋白質(zhì)的分離與純化

第四章核酸與蛋白質(zhì)的分離與純化2015年1月20日，美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬在國(guó)情演講中啟動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃。精準(zhǔn)醫(yī)療是以個(gè)體化醫(yī)療為基礎(chǔ)、隨著基因組測(cè)序技術(shù)快速進(jìn)步以及生物信息與大數(shù)據(jù)科學(xué)的交叉應(yīng)用而發(fā)展起來的新型醫(yī)學(xué)概念與醫(yī)療模式。課程要求掌握

DNA、RNA及蛋白質(zhì)的分離與純化原理分離與純化核酸與蛋白質(zhì)的注意事項(xiàng)熟悉核酸與蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)的應(yīng)用前景了解本章課程內(nèi)容1核酸分離與純化的基本原則及技術(shù)路線DNA的分離與純化2RNA的分離與純化3蛋白質(zhì)的分離與純化4核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。包括DNA（脫氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。而基因是控制生物遺傳結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，是有遺傳效應(yīng)的DNA片段。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，具有生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、防

御、調(diào)控等多種生理功能。得到高度純化，同時(shí)具有生物活性的目標(biāo)物質(zhì)是研究核酸和蛋白質(zhì)的

關(guān)鍵問題。從分子水平上認(rèn)識(shí)生命的現(xiàn)象已經(jīng)成為現(xiàn)代生物科學(xué)發(fā)展的主要方向，核酸和蛋白質(zhì)作為體內(nèi)最重要的生物大分子，是生命體結(jié)構(gòu)和功能的重要基礎(chǔ)。因此，核酸及蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)起到?jīng)Q定性作用。前言1核酸分離與純化的基本原則及技術(shù)路線核酸分離與純化的基本原則核酸分離與純化的技術(shù)路線1核酸分離與純化的基本原則及技術(shù)路線核酸分離與純化的基本原則核酸分離與純化的技術(shù)路線核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3’,5’—磷酸二酯鍵連接成的一類生物大分子，包括核糖核酸RNA和脫氧核糖核酸DNA兩類。真核生物染色體DNA(細(xì)胞核,內(nèi)雙鏈線狀)細(xì)胞器DNA(線粒體或葉綠體,雙鏈環(huán)狀)原核生物染色體DNA質(zhì)粒DNA(雙鏈環(huán)狀)(雙鏈環(huán)狀)核酸簡(jiǎn)介核酸分離與純化的基本原則保持核酸結(jié)構(gòu)的完整性控制緩沖液酸堿度：pH4~10注意機(jī)械剪切力提取溫度：0~4度注意核酸酶1蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)這類生物大分子雜質(zhì)對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子其他核酸分子盡量排除其他分子的污染21核酸分離與純化的基本原則及技術(shù)路線核酸分離與純化的基本原則核酸分離與純化的技術(shù)路線核酸分離與純化的技術(shù)路線主要技術(shù)路線核酸的釋放核酸的分離與純化核酸的濃縮、沉淀與洗滌核酸鑒定與保存機(jī)械法不適合真核基因組DNA，非機(jī)械法中溶胞法應(yīng)用最廣泛破碎細(xì)胞方法機(jī)械法固體剪切作用珠磨法壓榨液體剪切作用高壓均漿超聲破碎非機(jī)械法干燥法溶胞法酶溶法化學(xué)法物理法核酸分離與純化的技術(shù)路線核酸分離純化的第一步就是裂解細(xì)胞，釋放核酸。核酸的釋放1分離純化步驟越多，核酸純度高但得率低；分離純化步驟越簡(jiǎn)化，得率高純度低。復(fù)雜的混合物中純化核酸時(shí)，清除的主要雜質(zhì)包括三部分：核酸分離與純化的技術(shù)路線核酸分離純化的方法應(yīng)結(jié)合核酸制備的用途加以合適設(shè)計(jì)。核酸的分離與純化2（1）核酸的濃縮①固體聚乙二醇（PEG）濃縮將DNA溶液裝入透析袋，包埋于PEG使DNA脫水。核酸分離與純化的技術(shù)路線核酸濃縮常選用有機(jī)溶劑沉淀法②丁醇抽提濃縮正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振蕩混合后離心，去除有機(jī)相，可顯著減少DNA體積。核酸的濃縮、沉淀與洗滌3沉淀的特點(diǎn)1.易將核酸溶液調(diào)至所需濃度2.改變?nèi)芙夂怂岬木彌_液種類3.去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子核酸分離與純化的技術(shù)路線沉淀是濃縮核酸最常用且高效的方法。可選擇有機(jī)溶劑沉淀核酸加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后可用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的鹽，可使用70~75%的乙醇洗滌。（2）核酸的沉淀與洗滌(DNA樣品含有鹽，會(huì)使A260偏高，此時(shí)需測(cè)A310以扣除背景，并以A260與A310差值作為定量計(jì)算的依據(jù)）A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml（1）紫外分光光度法測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值只用于測(cè)定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液核酸分離與純化的技術(shù)路線UVmini1240UV1700UV2450/2550島津紫外可見分光光度計(jì)系列如計(jì)算DNA濃度核酸的鑒定-濃度鑒定4原理：熒光染料溴化乙錠（EB），可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。核酸分離與純化的技術(shù)路線特點(diǎn)：適用于低濃度核酸溶液的定量分析,高靈敏度：1-5ng，但具有強(qiáng)致癌性（2）熒光光度法熒光光度法（1）紫外分光光度法

A260

/A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)污染和鑒定核酸純度的重要指標(biāo)。

純的DNAA260與A280之比應(yīng)在1.8

純的RNAA260與A280之比應(yīng)在2.0

（2）熒光光度法

用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。核酸分離與純化的技術(shù)路線核酸的鑒定-純度鑒定4核酸凝膠電泳法：以溴化乙錠為示蹤劑，結(jié)果可判定核酸制品的完整性。；核酸分離與純化的技術(shù)路線總RNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染?；蚪MDNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象正常時(shí)，28SRNA的熒光強(qiáng)度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解。核酸的鑒定-完整性鑒定4核酸分離與純化的技術(shù)路線由于反復(fù)凍融產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)核酸樣品有斷裂作用，在實(shí)際保存時(shí)，最好將核酸制品小量分裝保存。核酸的保存5TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年TE緩沖液的pH與DNA貯存有關(guān)，pH為8.0時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，pH低于7.0時(shí)DNA容易變性。在DNA溶液中加少量氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染（1）DNA的保存可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液，-70℃保存可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，-20℃保存。以焦碳酸二乙酯水溶解可抑制RNA酶對(duì)RNA的降解。（2）RNA的保存2DNA的分離與純化基因組DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化DNA片段的回收2DNA的分離與純化基因組DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化DNA片段的回收真核生物染色體DNA潛在反應(yīng)基團(tuán)隱藏在螺旋內(nèi)部，由于堿基對(duì)外側(cè)受磷酸和戊糖的保護(hù)，并且內(nèi)部堿基堆積力的作用進(jìn)一步加強(qiáng)。真核生物DNA具有強(qiáng)化學(xué)耐受性核內(nèi)染色體DNA，惰性很強(qiáng)的分子基因組DNA的分離與純化真核生物DNA的特性1大于150kb的DNA分子多數(shù)易被切斷高分子量的DNA在物理上易被破壞。溶液中形態(tài)：長(zhǎng)而彎曲的形態(tài)，易卷曲，黏滯。易受到吸液、振蕩、攪拌等引起的剪切作用而斷裂相對(duì)分子質(zhì)量大的哺乳動(dòng)物DNA對(duì)機(jī)械剪切力敏感,提純時(shí)難保證完整性相對(duì)分子質(zhì)量小的噬菌體DNA，采用常規(guī)方法不會(huì)造成其DNA的斷裂DNA易以片段形式被分離基因組DNA的分離與純化基因組DNA的分離與純化真核細(xì)胞基因組DNA分離純化一般路線2基因組DNA的分離與純化提取注意事項(xiàng)盡量避免DNA斷裂和降解提取方法：

1、溫和裂解細(xì)胞并溶解DNA，使DNA與組蛋白分離，并完整地以可溶形式分離出來。

2、采用酶學(xué)或化學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNA及其他大分子?；蚪MDNA的分離與純化細(xì)胞的破碎3真核細(xì)胞基因組DNA分離純化主要方法有：酚抽取法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，各種快速方法等?；蚪MDNA的分離與純化不同哺乳動(dòng)物基因組DNA提取方法比較真核細(xì)胞基因組DNA分離純化方法4本法最初于1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立基因組DNA的分離與純化EDTA和SDS存在下，蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白PH8.0的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀123改良方法獲得DNA大小100-150kb（1）酚抽提法基因組DNA的分離與純化基因組DNA的分離與純化酚抽提法制備基因組DNA流程圖基因組DNA的分離與純化基因組DNA的分離與純化二價(jià)金屬離子螯合劑1.抑制DNA酶活性2

降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性生物陰離子去污劑1.降解細(xì)胞膜2乳化脂質(zhì)及蛋白質(zhì)3.降解DNA酶4.避免DNA消化廣譜蛋白酶1.裂解細(xì)胞2.水解蛋白質(zhì)3.消化DNA酶1.使蛋白質(zhì)變性2.抑制DNA酶活性抽提出DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層的滯留主要試劑的作用酚抽提法可以從單層或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織及血液標(biāo)本中制備少于10ug大到數(shù)百ug的DNA樣品?；蚪MDNA的分離與純化溫和盡量減少酚-氯仿抽提次數(shù)混合時(shí)要溫和盡量保證DNA完整性

兩個(gè)原則防止DNase對(duì)DNA的降解減少對(duì)DNA的機(jī)械破壞注意事項(xiàng)方法：破碎細(xì)胞方法同酚抽提法，用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合，再透析獲得DNA，分子量一般大于200kb方法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液饒于玻棒，生成DNA約80kb。應(yīng)用：適用于構(gòu)建高容量載體的DNA文庫(kù)和進(jìn)行分子質(zhì)量巨大的DNA片段的脈沖場(chǎng)凝膠電泳基因組DNA的分離與純化應(yīng)用：適用于Southern印跡雜交和PCR反應(yīng)。（2）甲酰胺解聚法（3）玻璃棒纏繞法包括細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體、放線菌和藍(lán)綠藻等,是最簡(jiǎn)單的細(xì)胞生物體。病原微生物引起感染性疾病感染性疾病診斷復(fù)雜基因組DNA的分離與純化原核生物種類原核生物的簡(jiǎn)介1分子較大（細(xì)菌DNA可達(dá)2×109bp），易受機(jī)械剪切力破壞細(xì)菌種類比病毒復(fù)雜破壁比較困難原核生物DNA制備困難基因組DNA的分離與純化原核細(xì)胞基因組DNA的分離與純化2分離步驟基因組DNA的分離與純化鹽析法：在溶菌酶和SDS溶菌后直接加入固體NaCl或NaClO4

鹽析，離心除去蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑處理：使蛋白變性，離心分層后，變性蛋白將在水相與有機(jī)相之間的界面析出，易除去。（2）去除蛋白質(zhì)核糖核酸酶CsCl密度梯度離心或蔗糖密度梯度離心異丙醇選擇性沉淀DNA（3）去除RNA（1）破碎菌體使用去垢劑SDS或溶菌酶處理，充分破碎細(xì)胞壁EDTA抑制DNase的活性蔗糖提高溶液的黏度，減緩細(xì)胞破裂速度避免DNA斷裂基因組DNA的分離與純化常用方法學(xué)及評(píng)價(jià)得完整DNA,首先要純化病毒粒子：1.SDS或酚處理或兩者結(jié)合處理2.避免劇烈振蕩及攪拌防止DNA切斷，使用寬口吸管吸取DNA溶液基因組DNA的分離與純化病毒粒子的純化病毒核酸提?。篠DS-酚法病毒基因組DNA的分離與純化32DNA的分離與純化基因組DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化DNA片段的回收質(zhì)粒DNA的簡(jiǎn)介

質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制和穩(wěn)定遺傳的共價(jià)閉合環(huán)DNA分子。

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA有一條鏈斷裂質(zhì)粒DNA在同一處兩條鏈都發(fā)生斷裂質(zhì)粒DNA的簡(jiǎn)介1DNA的擴(kuò)增（細(xì)菌培養(yǎng)）質(zhì)粒DNA的釋放（菌體的裂解）質(zhì)粒DNA的分離與純化

質(zhì)粒DNA分離常用方法：煮沸裂解法，堿裂解法，SDS裂解法質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA提取基本大致過程質(zhì)粒DNA的分離2質(zhì)粒DNA的分離與純化原理：在NaOH提供的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞膜使細(xì)胞裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)DNA及蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)單、重復(fù)性好而且成本低，是使用最廣泛的方法。質(zhì)粒DNA的分離與純化堿裂解法流程圖（1）堿裂解法質(zhì)粒DNA的分離與純化原理利用溶菌酶和TritonX-100破壞細(xì)胞壁，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。應(yīng)用該法劇烈，只用于提取相對(duì)分子質(zhì)量小(＜15kb)的質(zhì)粒DNA，

1.適用于大多數(shù)E.coli菌株,

2.不適宜會(huì)釋放出大量糖類的菌株及表達(dá)核酸內(nèi)切酶EndA的菌株。質(zhì)粒DNA的分離與純化（2）煮沸裂解法加熱：使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性降溫：質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體DNA不能復(fù)性質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化SDS裂解法流程圖(以動(dòng)物組織為例）裂解較溫和,常用的抽提方法將細(xì)菌懸浮在等滲的蔗糖溶液中

以溶菌酶和EDTA裂解，酚-氯仿抽提適合相對(duì)分子質(zhì)量大(＞15kb)的質(zhì)粒DNA的抽提，但產(chǎn)率不高（3）SDS裂解法質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA純化CsCl-EB法聚乙二醇沉淀法柱層析法質(zhì)粒DNA的分離與純化純化質(zhì)粒DNA的常用方法質(zhì)粒DNA的純化3質(zhì)粒DNA的分離與純化①氯化銫-溴化乙錠密度梯度平衡離心法（CsCl-EB法）特點(diǎn)容量大、分辨率高、純化效果好，純化的首選方法。費(fèi)時(shí)，設(shè)備與試劑昂貴。原理細(xì)菌裂解液+氯化銫+溴化乙錠（EB）1.蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層

2.RNA密度最大沉于管底

3.DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開。開環(huán)或線性DNA油蛋白質(zhì)閉環(huán)DNARNA沉淀質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化②聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀：是一種分級(jí)沉淀簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、適用廣，適用于分子克隆中所有常規(guī)的酶學(xué)反應(yīng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒DNA的分離與純化特點(diǎn)沉淀原理示意圖質(zhì)粒DNA的分離與純化③柱層析法純化關(guān)鍵是用于填充層析柱的樹脂。樹脂分類：疏水的相互作用

離子交換與吸附的相互作用原理質(zhì)粒DNA的分離與純化柱層析法純化細(xì)菌質(zhì)粒DNA1.高鹽下，DNA與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進(jìn)行純化。2.高鹽造成磷酸二酯骨架脫水，暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用50%的乙醇洗去RNA和糖類物質(zhì)，再加入TE或水，離心洗脫。質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化純化常用方法比較2DNA的分離與純化基因組DNA的分離與純化質(zhì)粒DNA的分離與純化DNA片段的回收主要是從瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離回收DNA片段。DNA片段的回收待回收DNA樣品瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)DNA切膠回收DNADNA回收基本流程DNA片段回收的原則與要求1DNA片段的回收DNA片段的回收DNA片段回收的原則1.提高回收量2.清除雜質(zhì)提高DNA樣品的上樣量，減少回收體積。常用方法為有機(jī)溶劑抽提法與商品化的柱層析法DNA片段的回收DNA片段的回收從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段2每種回收方法有其適用范圍，應(yīng)根據(jù)不同要求精選不同方法。DNA片段的回收聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法是碾碎浸泡法。DNA片段的回收從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段33RNA的分離與純化RNA制備條件與環(huán)境總RNA的分離與純化mRNA的分離與純化3RNA的分離與純化RNA制備條件與環(huán)境總RNA的分離與純化mRNA的分離與純化RNA制備條件與環(huán)境排除RNase的污染且抑制其活性是純化成功與否的關(guān)鍵。1.避免細(xì)胞外RNase的污染并抑制其活性2.抑制細(xì)胞內(nèi)RNase的活性并去除RNase。一般原則環(huán)境一般原則與環(huán)境1實(shí)驗(yàn)室保持潔凈戴手套和口罩玻璃器皿200℃干烤2hDEPC水處理冰浴試劑，嚴(yán)格洗滌、消毒處理選用一次性材料及新包裝的化學(xué)試劑3RNA的分離與純化RNA制備條件與環(huán)境總RNA的分離與純化mRNA的分離與純化總RNA的分離與純化總RNA的分離與純化的方法2分離與純化過程中使用的試劑與其用途1總RNA提取法中最常使用的方法。2.以異丙醇沉淀RNA，可選擇性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的總RNA中rRNA和mRNA比例高，小分子量RNA較少總RNA的分離與純化一步法特點(diǎn)

：簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和高效，RNA提取質(zhì)量高，且高完整性與純度。總RNA的分離與純化經(jīng)典的一步法，由Chomczynski和Sacchi于1987年提出。（1）異硫氰酸胍-酚氯仿一步法以（異）硫氰酸胍-酚為裂解液，再加入氯仿形成兩相，變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相之間，上層RNA溶液，最后異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌。總RNA的分離與純化（2）商品化的單相裂解試劑法—改良方法（3）其它方法(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法鹽酸胍-有機(jī)溶劑法LiCl-尿素法熱酚法3RNA的分離與純化RNA制備條件與環(huán)境總RNA的分離與純化mRNA的分離與純化Poly(A+)：絕大多數(shù)mRNA在其3‘末端帶有一個(gè)長(zhǎng)短不一的poly(A)尾巴起始材料：總RNA樣品mRNA的分離與純化mRNA的分離與純化基本原理1方法：oligo(dT)-纖維素或poly(U)-瓊脂糖凝膠的親和層析利用核酸的堿基配對(duì)原理，同時(shí)分離不同種類與大小的mRNA的分子群體mRNA的分離與純化mRNA制備的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法。1.oligo(dT)-纖維素柱層析法mRNA的分離與純化方法2mRNA的分離與純化1.分離速度慢，柱易堵塞2.不適合同時(shí)對(duì)多個(gè)標(biāo)本的處理3.難回收全部的poly(A+)RNA4.不適少量RNA樣品的分離純化哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備大量mRNA首選方法缺點(diǎn)可達(dá)總RNA的1%～10%提取數(shù)量必須防止RNase的污染：總RNA溶液65℃中溫育再冷卻至室溫后上樣，oligo(dT)-纖維素柱可在4℃儲(chǔ)存并反復(fù)使用注意事項(xiàng)mRNA的分離與純化2.oligo(dT)-纖維素柱離心法適用情況制備的mRNA可用于Northern雜交、RT-PCR及體外翻譯。優(yōu)點(diǎn)克服了oligo(dT)-纖維素層析柱法流速慢、易堵塞等不足

通過一系列可離心的分離層析柱，達(dá)到快速制備的目的。多個(gè)樣品的批量處理，具有快速、產(chǎn)量高及質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)原理：不用填柱mRNA的分離與純化3.oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)批量處理多個(gè)樣品，能從少量的RNA樣品中分離出poly(A)+RNA離心,收集70%的乙醇洗脫,沉淀原理利用oligo(dT)與poly(A)的互補(bǔ)配對(duì)特性、生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合和磁性分離。mRNA的分離與純化4.磁性球珠分離法磁性球珠分離法mRNA原理特點(diǎn)產(chǎn)量提高,回收率高70%~100%,純度高，缺點(diǎn)細(xì)胞和組織的處理量不超過1g，磁珠價(jià)格貴適用情況能用于幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)mRNA的分離與純化5.其他方法poly（U）-濾紙法在共價(jià)交聯(lián)有poly（U）的濾紙上點(diǎn)樣總RNA,再經(jīng)洗滌后加熱洗脫poly(U)-凝膠層析法Poly（U）-凝膠層析法利用poly（U）與poly(A)的互補(bǔ)配對(duì)原理。4蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則原材料的準(zhǔn)備與處理蛋白質(zhì)的精制純化蛋白質(zhì)的粗制分離蛋白質(zhì)純化后處理4蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則原材料的準(zhǔn)備與處理蛋白質(zhì)的精制純化蛋白質(zhì)的粗制分離蛋白質(zhì)純化后處理蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則不同蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)由氨基酸殘基的種類、數(shù)目和序列決定。性質(zhì)分離方法分子的大小與形狀超濾、透析、密度梯度離心、凝膠過濾層析、凝膠電泳在不同溶劑中的溶解度沉淀法、相分配法、分配層析法、結(jié)晶、溶劑抽提、逆流分配電荷分布性質(zhì)電泳技術(shù)、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、聚焦層析、等電聚焦電泳生物功能專一性親和層析（DNA親和層析、免疫親和層析、外源凝集素親和層析等）疏水性疏水作用層析、反相HPLC蛋白質(zhì)分離純化主要的技術(shù)和方法如下表所示：蛋白質(zhì)特性是分離純化的依據(jù)1蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則1.材料的選擇與破碎2.建立蛋白質(zhì)的活性測(cè)定方法3.分離純化應(yīng)遵循分級(jí)分離、先粗后細(xì)的原則4.分離純化條件設(shè)計(jì)原則蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則蛋白質(zhì)分離與純化基本流程4蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則原材料的準(zhǔn)備與處理蛋白質(zhì)的精制純化蛋白質(zhì)的粗制分離蛋白質(zhì)純化后處理富含所要純化的蛋白質(zhì)并易于處理的材料。1.不同生物材料選用不同破碎方法：2.常用的破碎方法有機(jī)械法，物理法

化學(xué)法，裂解法，酶解法等。原材料的準(zhǔn)備及處理原材料選擇原則預(yù)處理-破碎組織或細(xì)胞原材料的選擇及預(yù)處理2①超聲破碎法②滲透壓法③凍融法①高速組織搗碎法②人工研磨法③高壓擠壓法④玻璃勻漿器勻漿法原材料的準(zhǔn)備及處理①溶劑處理法②去污劑處理法①自溶法②酶解法1.機(jī)械法2.物理法3.化學(xué)法4.酶解法5.裂解法通過使用裂解液使細(xì)胞裂解，常用的比較如下表所示原材料的準(zhǔn)備及處理4蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則原材料的準(zhǔn)備與處理蛋白質(zhì)的精制純化蛋白質(zhì)的粗制分離蛋白質(zhì)純化后處理目的：將目標(biāo)蛋白質(zhì)與細(xì)胞中其他物質(zhì)分離，由固相轉(zhuǎn)入液相，或從細(xì)胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入到外界特定的溶液中。蛋白質(zhì)的粗制分離定義：將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于特定溶劑，使待純化的蛋白質(zhì)充分釋放到溶劑中，并盡量保持其原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性的過程。方法：根據(jù)蛋白質(zhì)可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液及有機(jī)溶溶劑作為依據(jù)。蛋白質(zhì)的粗制分離方法3（1）水溶液提取分離法蛋白質(zhì)的粗制分離②溫度：在一定溫度范圍內(nèi)(0～40℃之間)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加①鹽析法：最經(jīng)典的方法，常用來進(jìn)行粗分離，常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨③等電點(diǎn)法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)pH時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于凝集和沉淀，它的溶解度達(dá)到最低。和脂質(zhì)結(jié)合牢固/分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)由于親水性和較強(qiáng)的親脂性,可用有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、丁醇等蛋白質(zhì)的粗制分離（2）有機(jī)溶劑提取法4蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則原材料的準(zhǔn)備與處理蛋白質(zhì)的精制純化蛋白質(zhì)的粗制分離蛋白質(zhì)純化后處理通過蛋白質(zhì)粗制分離，體積較大的雜質(zhì)大部分已被除去，在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步對(duì)含有的目標(biāo)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)的精制純化常用方法：柱層析法、梯度離心法、電泳法最常用方法為柱層析法，后幾種方法常用作最后的精制純化過程特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、處理量大，提高分辨率、濃縮蛋白質(zhì)溶液

但分離規(guī)模較小蛋白質(zhì)的精制純化方法4了解需要純化的蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、溶解性及穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，而選擇合適的層析方法、層析介質(zhì)、加樣、洗滌與洗脫條件,一般層析技術(shù)選擇如下：蛋白質(zhì)的精制純化層析技術(shù)的選擇凝膠過濾法離子交換層析法或親和層析法最后的精制純化階段第一次層析階段分辨率高，純化效果好，脫鹽專一性強(qiáng)，純化倍數(shù)高蛋白質(zhì)的精制純化（1）親和層析親和層析的基本過程特點(diǎn)：特異性好，選擇性高，但具有局限性原理利用生物大分子與其特異性配基的專一性識(shí)別和可逆性結(jié)合而建立起來的分離方法。應(yīng)用生物特異性親和層析：免疫親和層析,凝集素親和層析,人工配體親和層析蛋白質(zhì)的精制純化依據(jù)蛋白質(zhì)具有等電點(diǎn)溶液pH值=等電點(diǎn)，蛋靜電荷為=0，溶液ph值>等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，溶液ph值<等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)帶正電荷（2）離子交換層析離子交換層析分離原理示意圖影響因素PH值，交換基團(tuán)類型，鹽濃度，上樣量，柱的塔板數(shù)，洗脫梯度和流速常用離子交換劑纖維素離子交換劑，交聯(lián)聚糖離子交換劑，瓊脂糖離子交換劑蛋白質(zhì)的精制純化電泳法的選擇原理在電場(chǎng)作用下,帶電顆粒向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。常用電泳類型包括區(qū)帶電泳，等電聚焦電泳及雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)的精制純化（1）等電聚焦原理利用具有不同等電點(diǎn)（pI）的蛋白質(zhì)在線性pH梯度下泳動(dòng)（蛋白質(zhì)所處的pH<pI時(shí)，向著負(fù)極移動(dòng)，反之則向正極移動(dòng)），并聚焦于與其pI值相同的pH位置，達(dá)到蛋白質(zhì)混合物分離的方法。常用電泳膠固相pH梯度干膠條（IPG）應(yīng)用常聯(lián)用其他電泳，如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS)及毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)的精制純化（2）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS的作用斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵

分子去折疊

破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)SDS和還原劑(巰基乙醇,二硫蘇糖醇DTT)的作用分子被解聚或組成它們的多肽鍵氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的精制純化（3）雙向凝膠電泳(2-DE)目前最有效,分辨率最高的蛋白質(zhì)電泳手段雙向凝膠電泳=等電聚焦電泳+SDS電泳雙向凝膠電泳示意圖4蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則原材料的準(zhǔn)備與處理蛋白質(zhì)的精制純化蛋白質(zhì)的粗制分離蛋白質(zhì)純化后處理指除去純化手段提純的蛋白質(zhì)溶液中常常含有的多余的鹽離子濃度的過程。脫鹽的主要方法有三種，即透析法、超濾法、凝膠過濾法。蛋白質(zhì)的純化后處理1.脫鹽5脫鹽、濃縮、干燥和保存蛋白質(zhì)的純化后處理低濃度溶液通過去除溶劑變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程.常用的濃縮方法2.濃縮超濾法：減壓濃縮法：真空度，液體沸點(diǎn)有關(guān)吸收法：聚乙二醇(PEG)、蔗糖、凝膠等沉淀法：硫酸銨沉淀法，聚乙二醇沉淀，免疫沉淀法，有機(jī)溶劑沉淀真空干燥：其原理與減壓濃縮相同，真空度愈高，溶液沸點(diǎn)愈低，蒸發(fā)愈快。通常適用于不耐高溫、易氧化物質(zhì)的干燥和保存。蛋白質(zhì)的純化后處理3.干燥蛋白質(zhì)通過制備得到所需的產(chǎn)品后，為了防止變質(zhì)、保持生物活性、易于保存和運(yùn)輸，常常需要干燥處理冷凍真空干燥：在真空干燥原理的基礎(chǔ)之上增加溫度因素。適用于各類蛋白質(zhì)的干燥保存。常用的干燥方法蛋白質(zhì)的純化后處理4.樣品的保存保存方法與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及保持生物活性