高三生物一輪復習DNA的提取與鑒定

答案第=page11頁，總=sectionpages11頁答案第=page22頁，總=sectionpages33頁考點四DNA的粗提取與鑒定1.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）及原理思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。原理：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來，達到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA二苯胺試劑的配制：稱取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml濃硫酸，用棕色瓶保存。臨用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml體積分數(shù)為0.2%的乙醛溶液。鑒定原理：DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，后者與二苯胺試劑反應生成藍色物質(zhì)。2.DNA分子的理化性質(zhì)（1）DNA的溶解性:DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。蛋白質(zhì)的鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。蛋白質(zhì)的鹽析：在鹽溶度升高到一定值后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨鹽濃度的升高而降低，結(jié)果蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。(2)DNA不溶于酒精溶液。但細胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離?！居美渚凭珴饪s和沉淀DNA時，所用的95%的酒精必須經(jīng)過預冷后才能使用】(3)DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。①蛋白酶——水解蛋白質(zhì)，對DNA沒有影響②高溫——大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃,而DNA在80℃以上才會變性【蛋白質(zhì)變性會沉淀，DNA變性只是解鏈，并不沉淀】③洗滌劑——瓦解細胞膜，但對DNA沒有影響【洗滌劑：離子去污劑（可有沐浴露、洗潔精等）,雙親分子，能使細胞膜被乳化，造成細胞膜被破壞，細胞解體。原因：洗滌劑中含有十二烷基硫酸鈉和堿。可以使細胞破裂，蛋白質(zhì)變性，使蛋白質(zhì)與DNA分離，有利于DNA釋放。】植物細胞需要先用洗滌劑處理。動物細胞膜外面沒有細胞壁，不需要用洗滌劑破壞。3、實驗步驟：（一）實驗材料的選取從下列材料中選取2～3種：菜花、香蕉、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜；魚卵、豬肝、雞血、哺乳動物的紅細胞；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮。但是，選用DNA含量相對較高的組織，成功的可能性更大目前常用材料：新鮮的雞血（注意要加入檸檬酸鈉，防止血液凝固）原因：雞血細胞中DNA含量豐富，且材料易得。【盛放雞血細胞液的容器最好是塑料器具，因為DNA容易被玻璃制品吸附，影響最終的DNA提取量?！克伎迹耗芊襁x用牛、羊、豬紅細胞血做實驗材料？為什么？不能。因為哺乳動物成熟的紅細胞中無細胞核、細胞器，不含DNA.（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液（1）動物細胞動物細胞的破碎較易，以雞血為例，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。討論1：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲溶液，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。①攪拌的目的：（注意應沿一個方向快速攪拌，但也不能過快過猛，防止打碎DNA）加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA②過濾后收集濾液：獲得含核物質(zhì)的濾液（獲取含DNA的濾液）（注意：此時釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應用3——4層紗布進行過濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)）③濾液中可能含有的細胞成分：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)（為了純化提取的DNA需要將濾液作進一步處理）（2）植物細胞①植物細胞需要先用一定的洗滌劑溶解細胞膜討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。【本課題使用的洗滌劑是多組分的混合物，在嚴格的科學實驗中很少使用】②實例：提取洋蔥DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液討論：如果研磨不充分，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？答：研磨不充分會使細胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結(jié)果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等（三）除去濾液中的雜質(zhì)方案一：含DNA的濾液＋2mol/LNaCl（DNA溶解）→過濾得到濾液→加入蒸餾水，調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L（DNA析出）→過濾得到含DNA的粘稠物→2mol/LNaCl溶液中溶解→過濾得到含DNA純度較高的濾液思考1：加入2mol/L的NaCl溶液，攪拌1min，注意應沿一個方向，目的是？目的是使DNA充分溶解思考2：過濾溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，獲得什么？這一步過濾的目的是？獲得含DNA的濾液目的是：除去不溶的雜質(zhì)思考3：加蒸餾水的目的是？調(diào)節(jié)NaCl溶液物質(zhì)的量為接近0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出。實驗中應該緩慢貼壁加入蒸餾水，直至溶液中黏稠物不再增加并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。同時應注意控制加水量，使NaCl溶液的始終濃度為0.1～0.2mol/L。加水太多、溶液過稀，會使DNA分子又重新溶解。思考4：這一步攪拌的目的是？（輕輕地沿一個方向不停地均與攪拌）稀釋NaCl溶液,析出DNA黏稠物思考5：這一步過濾含DNA黏稠物的0．14mol/L的NaCl溶液，獲得什么？獲得DNA黏稠物（紗布上的DNA黏稠物）思考6：過濾的目的？獲得DNA黏稠物。除去溶液中的雜質(zhì)討論：為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。原理：利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；原理：利用DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，使蛋白質(zhì)變性，沉淀，與DNA分離（四）DNA的析出與鑒定（1）DNA的析出濾液+同體積、冷卻的95%酒精，靜置→白色絲狀物→玻璃棒沿一個方向攪拌①攪拌的目的(玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌)：卷起DNA絲狀物，獲取含雜質(zhì)較少的DNA②冷卻的酒精溶液(體積分數(shù)95％)作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。（2）DNA的鑒定①向兩支試管中分別加入2mol/LNaCl溶液5ml②其中一支試管中加入DNA絲狀物，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解③向兩支試管中各加入二苯胺試劑4ml④混勻后，置于沸水浴中加熱5min⑤待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液的顏色變化觀察現(xiàn)象：溶解絲狀物的溶液變?yōu)樗{色【鑒定時藍色的深淺與溶液中DNA的含量多少有關(guān)】思考1：DNA和RNA在細胞中的分布實驗中用的試劑是？甲基綠不能用二苯胺，原因沸水浴會使細胞內(nèi)成分位置移動思考2：可以單獨用甲基綠鑒定某種物質(zhì)是否是DNA嗎？不可以，甲基綠同樣會和RNA結(jié)合呈綠色！4、DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、2、4、4、6”加蒸餾水2次第一次：加到雞血細胞中，使雞血細胞吸水張破(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA第二次：加到含有DNA的物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液，調(diào)節(jié)NaCl溶液物質(zhì)的量濃度下降到0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出析出DNA2次第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液析出DNA，過濾除去溶液中的雜質(zhì)第二次：用冷卻的95％的酒精，獲得含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物（利用DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精）用紗布過濾4次過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細胞液：獲得含核物質(zhì)的濾液過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液：得到含DNA的濾液過濾含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液：獲取紗布上的DNA粘稠物過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液：得到含DNA的濾液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細胞核物質(zhì)；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA用玻璃棒攪拌6次第一次攪拌加蒸餾水的雞血細胞液：加速了雞血細胞的破裂第二次攪拌含DNA的2mol/LNaCl溶液的濾液：加速DNA溶解第三次攪拌加蒸餾水至0.14mol/L的NaCl溶液：稀釋NaCl溶液,析出DNA黏稠物第四次攪拌含DNA（紗布上的粘稠物）的高濃度鹽溶液：使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中第五次攪拌含DNA的體積分數(shù)為95%的酒精溶液：卷起DNA絲狀物，提取含雜質(zhì)較少的DNA第六次攪拌含DNA白色絲狀物的鹽溶液：加速DNA水解第1次快速攪拌,后5次都是緩慢攪拌，防止DNA分子斷裂5、注意事項①破碎細胞，釋放DNA的過程中，若是血細胞，加水后必須充分攪拌，不應少于5min；若是肝臟細胞或是植物細胞，則應與研磨液混合，必須充分研磨，研磨時間不少于10min②過濾含DNA的濾液時，不能用濾紙代替紗布，否則會因DNA吸附到濾紙上而損失大量DNA。③加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。④在用玻璃棒攪拌時，玻璃棒不能直接插燒杯底部，并且攪拌要輕緩，并沿同一個方向，以便獲得較完整的DNA分子⑤二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則二苯胺會變成淺藍色，影響鑒定效果。⑥提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。6、實驗現(xiàn)象不明顯的原因分析①材料中核物質(zhì)沒有充分釋放出來，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠②加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞③二苯胺配制時間過長，變成淺藍色，影響鑒定效果④析出含DNA的黏稠物時，蒸餾水一次快速加入，影響實驗結(jié)果⑤實驗中有多次攪拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作時不注意區(qū)分，影響實驗結(jié)果（注意