發(fā)酵工程實驗指導(dǎo)

發(fā)酵工程實驗指導(dǎo)第1頁/共18頁2乳酸菌的功能與應(yīng)用價值抗菌，防腐，抗氧化，微生態(tài)（益生菌等）發(fā)酵保健食品（酸奶）；發(fā)酵代謝產(chǎn)物：有機(jī)酸，胞外多糖，抗菌肽，等；果蔬發(fā)酵（酸菜等）；環(huán)境廢物轉(zhuǎn)化，環(huán)境保護(hù)；等。乳酸菌的應(yīng)用乳酸菌的功能第2頁/共18頁3發(fā)酵工程的研究內(nèi)容構(gòu)成★工業(yè)微生物（生產(chǎn)菌株）的分離與篩選；★菌株改造（菌種選育）★培養(yǎng)基制備技術(shù)；★發(fā)酵過程控制與優(yōu)化；★產(chǎn)物的分離與純化第3頁/共18頁4第一部分：乳酸菌的分離、篩選與保藏第二部分：乳酸菌的培養(yǎng)與發(fā)酵測定附上：實驗原始記錄實驗一：實驗準(zhǔn)備實驗二：乳酸菌的分離與篩選實驗三：菌種培養(yǎng)與保藏實驗四：乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)實驗五：乳酸菌發(fā)酵測定與產(chǎn)物分析一、實驗?zāi)康呐c意義及原理等二、材料與方法（或步驟）三、結(jié)果與分析問題回答實驗報告撰寫基本格式撰寫完成實驗報告（上交材料）實驗內(nèi)容設(shè)計第4頁/共18頁5實驗二時間安排周XX培養(yǎng)基制備；分離：劃線分離；稀釋分離選菌落，接入斜面培養(yǎng)基（標(biāo)記），培養(yǎng)；保存第5頁/共18頁6實驗乳酸菌菌株斜面移接活化細(xì)胞生長測定產(chǎn)酸變化注意點：新保存的菌株可直接接種，不必再活化。菌種移接至發(fā)酵三角瓶，培養(yǎng)(E2)（細(xì)胞生物量g/L：離心測菌體重量；混濁度描述）（測定pH變化：酸度計）發(fā)酵產(chǎn)物乳酸定性分析(E3)（薄層層析法）總實驗流程采樣分離(E1)乳酸菌菌株第6頁/共18頁7實驗一：培養(yǎng)基制備與器材準(zhǔn)備每組內(nèi)容每人倒1個平板用于劃線分離做一套稀釋倒平板，1個稀釋度倒平板1個斜面培養(yǎng)基每人1支，第一部分MRS培養(yǎng)基200ML，營養(yǎng)瓊脂30ML，無菌水試管4支（9ML），無菌移液管5支（1ML），注意：碳酸鈣按比例混合（MRS培養(yǎng)基200ML加5克）；培養(yǎng)基可幾個組合并配制。發(fā)酵模塊：共6個組，每3個組配600ML，營養(yǎng)瓊脂一個班配1瓶。第7頁/共18頁8分離得到的乳酸菌菌株（編號）菌落觀察生理生化特性（略）形態(tài)鑒定（略）采樣稀釋倒平板編號，斜面培養(yǎng)與保存（通過產(chǎn)酸特性直接鑒定）實驗二：乳酸菌的分離與培養(yǎng)第一部分第8頁/共18頁9實驗三乳酸菌菌種的培養(yǎng)與保藏分離得到的乳酸菌菌株（編號）斜面移接與培養(yǎng)(每一株）1株保藏1株待以下實驗用注意點：注明菌種編號與日期；如Lcd131,Lcd132；（例：陳丹，第一組第3位同學(xué)）第一階段結(jié)束，總結(jié)安排一周完成第9頁/共18頁10時間安排（制藥班級，21人）周三培養(yǎng)基制備；分離：劃線分離；稀釋分離周五選菌落，接入斜面培養(yǎng)基（標(biāo)記），培養(yǎng)；配制發(fā)酵培養(yǎng)基；（每個菌株接種2瓶平行實驗）下周一下周三接種發(fā)酵培養(yǎng)基（標(biāo)記），每個菌株接種2瓶。開始記錄時間。（16至24h內(nèi)檢測一次）發(fā)酵結(jié)束，樣品檢測，乳酸薄層層析法測定。（周二）（周四）（周四）第10頁/共18頁11實驗乳酸菌菌株斜面移接活化細(xì)胞生長測定（自選）產(chǎn)酸變化注意點：新保存的菌株可直接接種，不必再活化。實驗四乳酸菌培養(yǎng)與發(fā)酵測定菌種移接至發(fā)酵三角瓶，培養(yǎng)（細(xì)胞生物量g/L：離心測菌體重量；混濁度描述）（測定pH變化：酸度計）發(fā)酵產(chǎn)物乳酸定性分析（E3）（薄層層析法）總實驗流程第二部分第11頁/共18頁12發(fā)酵培養(yǎng)基的配制接種3環(huán)培養(yǎng)瓶包扎方法說明第12頁/共18頁13細(xì)胞生長的測定細(xì)胞濕密度：單位體積(ml)發(fā)酵液菌體的重量g（濕重）;

方法：取一定量(ml)發(fā)酵液，經(jīng)離心去除上清液，菌體稱重。

細(xì)胞濃度：單位體積(ml)活細(xì)胞數(shù)(cfu)，單位:cfu/ml

方法：取一定量(ml)發(fā)酵液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后。倒平板培養(yǎng)計數(shù)，再由菌落數(shù)與稀釋倍數(shù)的積。

光密度（OD）：反映細(xì)胞的混濁度；

方法：由分光光度計在一定波長下測定吸光值。

第13頁/共18頁14分析結(jié)束以后每一組清洗各自的實驗物品，包括斜面菌種等。請同學(xué)注意：發(fā)酵液預(yù)處理可直接取發(fā)酵清液，調(diào)pH至3左右因培養(yǎng)結(jié)束；最后一次分析檢測不用無菌操作！第14頁/共18頁15實驗五乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物（乳酸）的定性分析

---薄層層析法方法流程

1.發(fā)酵液預(yù)處理可直接取發(fā)酵上清液，調(diào)pH至3，另用自然pH做對照；

2.劃線及點樣時，不可將薄層刺破，點樣斑點直徑不超過2mm，重復(fù)點樣時要在同一位置。每次點樣后適當(dāng)吹干。

3.顯色時，注意噴霧均勻。

4.實驗數(shù)據(jù)處理：記錄顯色點與點樣點間的距離。發(fā)酵液預(yù)處理展開系統(tǒng)飽和點樣展開顯色操作注意事項記錄計算，等第15頁/共18頁16展層溶劑：正丁醇：甲酸：水=80：15：5（V/V/V）；展開系統(tǒng)的飽和：預(yù)先取適量配制好的展開劑注入層析缸一邊，將已點樣的的薄板也放入層析缸的另一邊，密閉層析缸15~20min，使展開液蒸汽飽和層析系統(tǒng)展開：將薄板移至有適量展開液的層析缸一邊展開；顯色：

3%的溴甲酚綠酒精溶液噴霧，再用熱風(fēng)吹干，注意：顯色液噴霧要足夠。顯色時間要充分。1、描述分離效果（作圖或照片顯示）；

2、計算Rf值；

3、分析實驗結(jié)果及誤差原因。（請記錄以下3個問題）四、實驗結(jié)果與討論具體操作步驟按照實驗指導(dǎo)書實驗報告內(nèi)容格式參照下頁；報告統(tǒng)一提交時間：13周-周四第16頁/共18頁171．菌種分離初篩結(jié)果表