第三章測(cè)序技術(shù)詳解

第三章測(cè)序技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共38頁(yè)。優(yōu)選第三章測(cè)序技術(shù)當(dāng)前2頁(yè)，總共38頁(yè)。人類基因組計(jì)劃

人類基因組計(jì)劃（Humangenomeproject）于1990年啟動(dòng)，我國(guó)于1999年加入該計(jì)劃，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號(hào)染色體短臂上約30Mb的測(cè)序任務(wù)。美國(guó)擔(dān)了54%，其次是英國(guó)，承擔(dān)了33%，日本為7%，法國(guó)為2.8%，德國(guó)為2.2%。

當(dāng)前3頁(yè)，總共38頁(yè)。二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成當(dāng)前4頁(yè)，總共38頁(yè)。2000年6月公共領(lǐng)域測(cè)序計(jì)劃工作框架圖當(dāng)前5頁(yè)，總共38頁(yè)。2002.112004.12水稻和雞基因組當(dāng)前6頁(yè)，總共38頁(yè)。華大基因于2007年10月完成了第一個(gè)中國(guó)人的高質(zhì)量基因組圖譜——“炎黃一號(hào)”2008年1月12日由中國(guó)、英國(guó)和美國(guó)的科學(xué)家在深圳、倫敦和華盛頓同時(shí)宣布國(guó)際“千人基因組計(jì)劃”正式啟動(dòng)。最終目標(biāo)是獲得歐、亞、美、非各洲不同人群中2500人的基因數(shù)據(jù)。

人基因組當(dāng)前7頁(yè)，總共38頁(yè)。大熊貓基因組-2010.1“大熊貓基因組”項(xiàng)目于2008年3月啟動(dòng)。研究表明，大熊貓有21對(duì)染色體，基因2萬(wàn)多個(gè)。當(dāng)前8頁(yè)，總共38頁(yè)。

破解古人類基因組-2010.2

“薩卡克(Saqqaq)”的人類群體，約在4750年前至2500年前居住于格陵蘭島，其后滅絕。Saqqaq古人的遺傳信息比公認(rèn)的美洲原住民(主要是印第安人和因紐特人，同屬黃種人)更加接近于現(xiàn)代東亞和西伯利亞人群。當(dāng)前9頁(yè)，總共38頁(yè)。人體腸道菌群元基因組-2010.3

收集了124個(gè)來(lái)自于歐洲人腸道菌群的樣本,這個(gè)基因集中包含了絕大部分目前已知的人體腸道微生物基因,但更多的是目前未知微生物的基因。從這個(gè)基因集中可以估計(jì)人腸道中存在約1000到1150種細(xì)菌,平均每個(gè)體內(nèi)約含有160種優(yōu)勢(shì)菌種,并且這些細(xì)菌是絕大部分個(gè)體所共有的。

當(dāng)前10頁(yè)，總共38頁(yè)。2009年4月啟動(dòng)了“世界三極動(dòng)物基因組計(jì)劃”2009年8月啟動(dòng)了“萬(wàn)種微生物基因組計(jì)劃”。2010年1月啟動(dòng)了“1000種動(dòng)植物基因組計(jì)劃”，計(jì)劃未來(lái)兩年內(nèi)為一千種重要?jiǎng)又参镞M(jìn)行測(cè)序，并從科學(xué)界征集測(cè)序物種的提案。

當(dāng)前11頁(yè)，總共38頁(yè)。（一）化學(xué)裂解法(Maxam＆Gilbert,1977)（二）雙脫氧鏈末端終止法(Sanger,1977)（三）DNA自動(dòng)化序列分析解讀生命的天書(shū)-DNA測(cè)序當(dāng)前12頁(yè)，總共38頁(yè)。

DNA測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)：

●高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技術(shù)

●

PAGE能分離長(zhǎng)度為300-500個(gè)堿基,差別僅1個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。

當(dāng)前13頁(yè)，總共38頁(yè)。核酸序列分析的基本原理化學(xué)降解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)當(dāng)前14頁(yè)，總共38頁(yè)。一、化學(xué)降解法測(cè)序的原理1、用放射性核素標(biāo)記待測(cè)DNA一側(cè)末端2、將標(biāo)記DNA分為G、A+G、C+T、C4個(gè)反應(yīng)體系3、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個(gè)，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯(cuò)落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列當(dāng)前15頁(yè)，總共38頁(yè)。堿基特異性修飾及裂解反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯鳥(niǎo)嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開(kāi)環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開(kāi)環(huán)六氫吡啶C當(dāng)前16頁(yè)，總共38頁(yè)。

化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet當(dāng)前17頁(yè)，總共38頁(yè)?；瘜W(xué)降解法基本步驟

(1)先將DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記(通常為放射性同位素32P；(2)在多組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾；(3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開(kāi)DNA鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長(zhǎng)短分開(kāi)；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列.

當(dāng)前18頁(yè)，總共38頁(yè)。當(dāng)前19頁(yè)，總共38頁(yè)。CT+CG+AATTGTCAGGAC試試看當(dāng)前20頁(yè)，總共38頁(yè)。二、雙脫氧鏈終止法（Sanger法）原理

DNA鏈中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基團(tuán)，在DNA合成、鏈的延長(zhǎng)過(guò)程中，新?lián)饺氲拿撗鹾塑账?’-p與前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯鍵相連。

當(dāng)前21頁(yè)，總共38頁(yè)。Sanger法是在反應(yīng)體系中加入2’,3’-ddNTP，由于其沒(méi)有3’-OH而不能與下一個(gè)核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。當(dāng)前22頁(yè)，總共38頁(yè)。在PCR時(shí)加入標(biāo)記的復(fù)制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應(yīng)于4種堿基）ddX的兩個(gè)作用：可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接電泳誰(shuí)終止，堿基就是誰(shuí)此方法獲1980年的Nobel獎(jiǎng)Sanger法：當(dāng)前23頁(yè)，總共38頁(yè)。當(dāng)前24頁(yè)，總共38頁(yè)。當(dāng)前25頁(yè)，總共38頁(yè)。5’3’5’AGCTATCAGCGAAT雙脫氧鏈終止法DNA序列分析原理示意圖當(dāng)前26頁(yè)，總共38頁(yè)。序列識(shí)讀自下而上，5’3’所讀序列為模板的互補(bǔ)鏈當(dāng)前27頁(yè)，總共38頁(yè)。三、DNA測(cè)序自動(dòng)化和大規(guī)模測(cè)序特點(diǎn):原理同sanger法標(biāo)記物為熒光染料（與雙脫氧核苷三磷酸共價(jià)相連)激光掃描自動(dòng)測(cè)序結(jié)果清晰、準(zhǔn)確、分辨率高測(cè)序速度快當(dāng)前28頁(yè)，總共38頁(yè)。DNA自動(dòng)測(cè)序步驟：

4種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物ddNTPsSanger測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離激光激發(fā)、熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析與DNA自動(dòng)排序。當(dāng)前29頁(yè)，總共38頁(yè)。第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測(cè)探頭電泳，看誰(shuí)跑得快當(dāng)前30頁(yè)，總共38頁(yè)。第二步：熒光檢測(cè)當(dāng)前31頁(yè)，總共38頁(yè)。DNA自動(dòng)測(cè)序與手工測(cè)序的不同點(diǎn)1、標(biāo)記物不同：手工測(cè)序采用放射性核素標(biāo)記，而自動(dòng)測(cè)序采用4種熒光染料分別標(biāo)記ddNTP或標(biāo)記引物2、加樣方式不同：手工測(cè)序，一個(gè)樣品的4個(gè)測(cè)序反應(yīng)物分別在不同泳道進(jìn)行，而自動(dòng)測(cè)序可在一個(gè)泳道內(nèi)電泳3、檢測(cè)手段不同：手工測(cè)序采用放射自顯影，從