臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)：分枝桿菌屬檢驗(yàn)

分枝桿菌屬

（Mycobacterium)第一節(jié)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群第二節(jié)非結(jié)核分枝桿菌第三節(jié)麻風(fēng)分枝桿菌

緩慢生長菌迅速生長菌不能培養(yǎng)菌麻風(fēng)分枝桿菌龜膿腫分枝桿菌群偶發(fā)分枝桿菌……分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌坎納分枝桿菌田鼠分枝桿菌卡介苗鳥分枝桿菌復(fù)合群堪薩斯分枝桿菌戈登分枝桿菌……非結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群培養(yǎng)7天內(nèi)長出菌落者培養(yǎng)7天以上長出菌落者分枝桿菌屬分類是一類直或微彎曲的桿菌，有分枝生長趨勢(shì)，抗酸染色陽性。細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高，耐酸堿,對(duì)氧和營養(yǎng)要求高，生長慢。不產(chǎn)生毒素和侵襲酶類，多為菌體成分致病，感染為慢性。分枝桿菌屬特點(diǎn)第一節(jié)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群

（Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)內(nèi)容分類臨床意義生物學(xué)特性微生物學(xué)檢驗(yàn)一、分類結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌坎納分枝桿菌田鼠分枝桿菌卡介苗結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率最高，約占90%。全球三大傳染疾病二、臨床意義愛滋?。ˋIDS）結(jié)核?。═B）瘧疾（Malaria）結(jié)核病近年來發(fā)病成上升趨勢(shì)，已成為危脅人類健康的嚴(yán)重的全球性重大公共衛(wèi)生問題。1.致病物質(zhì)莢膜脂質(zhì)：索狀因子磷脂硫酸腦苷酯

蠟質(zhì)D蛋白質(zhì)尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶，主要由細(xì)菌繁殖產(chǎn)生的炎癥、菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性、以及免疫損傷引起病變。主要致病物質(zhì)二、臨床意義抑制呼吸，慢性肉芽腫結(jié)核結(jié)節(jié)形成細(xì)胞內(nèi)存活佐劑、超敏反應(yīng)超敏反應(yīng)2.所致疾病

結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官感染，其中以肺結(jié)核最常見。二、臨床意義脊柱結(jié)核繼發(fā)性肺結(jié)核皮膚結(jié)核腦結(jié)核脊椎結(jié)核導(dǎo)致脊椎畸形患者

Bacteriacoughedupinsputum

InhalationofbacteriaBacteriareachlungs,entermacrophagesBacteriareproduceinmacrophagesLesionbeginstoform(caseousnecrosis)ActivatedmacrophagesBacteriaceasetogrow;lesioncalcifiesImmunesuppressionReactivationLesionliquefiesDeadphagocytes,necrosisM.tuberculosisPhagocytes,Tcells,andBcellstryingtokillbacteriaDeathSpreadtobloodorgans結(jié)核發(fā)展進(jìn)程結(jié)核病的預(yù)防二、臨床意義3.免疫性

TB菌的感染率很高，發(fā)病率卻較低。抗結(jié)核的免疫稱為有菌免疫?？贵w無保護(hù)作用，臨床輔助診斷有意義。細(xì)胞免疫發(fā)揮重要抗感染作用?？僧a(chǎn)生遲發(fā)性超敏反應(yīng)結(jié)核菌素試驗(yàn)二、臨床意義三、生物學(xué)特性1.形態(tài)結(jié)構(gòu)菌體細(xì)長略彎曲，有時(shí)可見分枝，抗酸染色呈紅色；呈單、成堆或成束排列；可出現(xiàn)多形性，在陳舊的病灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型。萋～尼抗酸性染色法染色，菌體染成紅色熒光染料金胺O染色，在熒光下菌體呈橘黃色2.培養(yǎng)特性饞:專性需氧,營養(yǎng)要求高（L-J培養(yǎng)基）懶:生長溫度35℃,生長緩慢,18小時(shí)繁殖一代丑:液體培養(yǎng)基呈粗糙皺紋狀菌膜生長,固體培養(yǎng)基（L-J)上形成形似菜花樣典型菌落。三、生物學(xué)特性典型形態(tài)－→多形性R型菌落－→S型菌落有毒－→無毒（卡介苗）抗結(jié)核藥敏感－→耐藥3.變異性三、生物學(xué)特性卡介苗：是有毒力的牛型結(jié)核分枝桿菌在甘油、膽汁和馬鈴薯的培養(yǎng)基中經(jīng)13年230次傳代而獲得的減毒變異株對(duì)某些理化因子的抵抗力較強(qiáng)：耐干燥耐酸堿耐一定濃度的孔雀綠濕熱紫外線酒精4.抵抗力“三耐三不耐”不耐受三、生物學(xué)特性

臨床標(biāo)本

涂片檢查

分離培養(yǎng)

HPLC分子鑒定免疫學(xué)鑒定直接涂片集菌涂片處理標(biāo)本或無污染標(biāo)本染色液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基動(dòng)物試驗(yàn)

（L-J培養(yǎng)基）抗酸..金胺O..

35℃涂片鏡檢儀器培養(yǎng)

＜7天生長＞7天生長快速生長菌慢生長菌初步鑒定

抗酸染色菌落特點(diǎn)鑒定試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)四、微生物學(xué)檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序（一）標(biāo)本采集據(jù)感染部位的不同采集不同的標(biāo)本疑肺結(jié)核：收集清晨第一口痰，清潔干燥的容器內(nèi)送檢。疑泌尿系結(jié)核：清晨第一次中段尿15ml送檢，必要時(shí)作無菌導(dǎo)尿送檢。采集膿液應(yīng)直接從潰瘍處取膿汁或分泌物,深部膿腫用無菌注射器抽取送檢其他：無菌抽取腦脊液、胸水、腹水及關(guān)節(jié)液等盛無菌試管送檢。腦脊液標(biāo)本靜置后，表面可有細(xì)薄凝塊，取凝塊作涂片或接種培養(yǎng)。常見標(biāo)本：痰、尿、胸腹水等

直接涂片或濃縮集菌涂片，使涂片面積大約為2cm×1cm大小，然后進(jìn)行金胺O熒光染色和抗酸染色。

（二）直接涂片檢查結(jié)核分枝桿菌金胺O染色，在熒光下菌體呈橘黃色結(jié)核分枝桿菌痰涂片抗酸染色（×1000）熒光染色（×450）結(jié)果報(bào)告－0／70視野

±

1～2／70視野＋2～18／50視野

2＋4～36／10視野

3＋4～36／每個(gè)視野

4＋>36／每個(gè)視野抗酸染色（×1000）結(jié)果報(bào)告

－

0／300視野

±

1～2條／300視野

＋1～9條/100視野

2＋1～9條/10視野

3＋1～9條/每個(gè)視野

4＋>9/每個(gè)視野（三）分離培養(yǎng)與鑒定1.標(biāo)本前處理：痰液標(biāo)本的前處理：標(biāo)本加等量的4%NaOH強(qiáng)力振蕩混勻約50秒室溫靜置30

分鐘加等量無菌磷酸鹽緩沖液中和離心3000g約

15

分鐘倒掉上清液，加無菌磷酸鹽緩沖液重懸2.分離培養(yǎng)（1）傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)基：處理過的標(biāo)本接種于Ｌ-Ｊ培養(yǎng)基培養(yǎng)條件：含5%--10%CO2大氣環(huán)境，最適生長溫度35--37℃，黑暗高濕度環(huán)境培養(yǎng)6--8周。（2）結(jié)核分枝桿菌的自動(dòng)化快速培養(yǎng)系統(tǒng)（四）分離培養(yǎng)與鑒定

3.生物學(xué)鑒定（1）初步鑒定：依據(jù)抗酸染色性、菌落特征、生長速度、色素產(chǎn)生等作出初步鑒定（2）生化試驗(yàn)鑒定

煙酸累積試驗(yàn)（+）、硝酸鹽還原（+）觸酶（+）、耐熱觸酶（-）

能被NAP抑制

不被T2H抑制、吡嗪酰胺酶（+）結(jié)核分枝桿菌（四）分離培養(yǎng)與鑒定4.免疫學(xué)鑒定（1）結(jié)核菌素試驗(yàn)：遲發(fā)型超敏反應(yīng)。（2）結(jié)核分枝桿菌抗原檢測（3）抗PPDIgG檢測

（四）分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)核菌素試驗(yàn)純蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液后的純化物。注入皮內(nèi)后如受試者已感染結(jié)核，則結(jié)核菌素與致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥。根據(jù)注射部位是否出現(xiàn)紅腫判斷結(jié)果＜10mm為陰性＞10mm為陽性48小時(shí)后（4）T-SPOT.TB檢測

利用外周抗凝全血標(biāo)本，通過檢測結(jié)核感染后T淋巴細(xì)胞分泌的特異性細(xì)胞因子γ干擾素，來診斷是否存在結(jié)核感染。5.分子生物學(xué)鑒定

各種PCR方法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA。

6.高效液相色譜（HPLC)分析鑒定

由于不同種的分枝桿菌細(xì)胞壁中的分枝菌酸不同，利用HPLC檢測分枝菌酸可鑒定菌種。（四）分離培養(yǎng)與鑒定根據(jù)CLSI文件M24-2A推薦：

結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)選擇的藥物主要是抗結(jié)核一線藥物如異煙肼、利福平、乙胺丁醇和比嗪酰胺等。

五、藥敏試驗(yàn)的藥物選擇第二節(jié)非結(jié)核分枝桿菌

（nontuberculosismycobacteria,NTM）本節(jié)主要內(nèi)容NTM的概述臨床上重要的NTMNTM的微生物學(xué)檢驗(yàn)NTM指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌，具有抗酸性，不是分類學(xué)上的名稱。廣泛分布于水和土壤中。條件致病，引起類似于結(jié)核分枝桿菌感染的慢性肺部疾病以及皮膚感染。感染不會(huì)通過人與人之間進(jìn)行傳播。概述1.不產(chǎn)色菌

本群細(xì)菌在光照和暗處均不產(chǎn)生色素。慢生長群（1）鳥分枝桿菌復(fù)合群（2）隱藏分枝桿菌臨床上重要的NTM快生長群（1）龜分枝桿菌-膿腫分枝桿菌群（2）偶發(fā)分枝桿菌群偶發(fā)分枝桿菌引起的注射后感染膿腫分枝桿菌引起的注射后感染NTM感染后難

于愈合的傷口2.光產(chǎn)色菌

均屬慢生長菌，其特點(diǎn)是菌落在暗處為奶油色，曝光1h后變?yōu)辄S色或橘黃色。

（1）堪薩斯分枝桿菌（2）海分枝桿菌臨床上重要的NTM3.暗產(chǎn)色菌（慢生長群和快生長群）這類細(xì)菌無論在有光或無光條件下均可產(chǎn)生色素，色素為黃色或橘黃色。與人類疾病有關(guān)的均是慢生長菌。

（1）戈登分枝桿菌（2）瘰疬分枝桿菌（3）蘇加分枝桿菌臨床上重要的NTM1.標(biāo)本采集

與結(jié)核分枝桿菌類似2.涂片抗酸染色

NTM為抗酸桿菌，但較結(jié)核分枝桿菌短而粗，大小約1-8μm×0.3-0.5μm，抗酸染色著色均勻，呈束狀或團(tuán)狀排列。NTM的微生物學(xué)檢驗(yàn)NTM純培養(yǎng)抗酸染色（×1000）3.分離培養(yǎng)與鑒定NTM的鑒定可跟據(jù)細(xì)菌生長速度、色素等表型特征進(jìn)行初步鑒定，再進(jìn)行分子鑒定，后者應(yīng)用越來越廣泛。NTM快速生長菌培養(yǎng)72小時(shí)菌落戈登分枝桿菌在L-J培養(yǎng)基上菌落4.其他鑒定方法NTM非培養(yǎng)方法的鑒定與結(jié)核分枝桿菌類似，可參考結(jié)核桿菌部分。第三節(jié)麻風(fēng)分枝桿菌

（Mycobacterium

Leprae）主要內(nèi)容臨床意義生物學(xué)特性微生物學(xué)檢驗(yàn)一、臨床意義麻風(fēng)分枝桿菌是麻風(fēng)病的病原菌，麻風(fēng)是一種慢性傳染病，主要表現(xiàn)為皮膚、粘膜和神經(jīng)末梢的損害。晚期可侵犯深部組織和器官，形成肉芽腫。傳染源：麻風(fēng)患者傳播途徑：直接接觸、飛沫傳播易感人群：多為免疫缺陷個(gè)體。根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細(xì)菌檢查結(jié)果等將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié)核樣型兩種病型。結(jié)核樣型麻風(fēng)患者手部病變體征瘤型麻風(fēng)的“獅面”外觀抗酸桿菌，呈束狀或團(tuán)狀排列，革蘭陽性無鞭毛、莢膜和芽胞。用藥后細(xì)菌可斷裂為顆粒狀、鏈桿狀等，著色不均勻。細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可形成麻風(fēng)細(xì)胞（即有麻風(fēng)桿菌存在、呈泡沫狀的細(xì)胞）。目前不能人工培養(yǎng)。二、生物學(xué)特性標(biāo)本涂片抗酸染色是診斷麻風(fēng)的主要依據(jù)PCR檢測麻風(fēng)菌基因、運(yùn)用新發(fā)現(xiàn)抗原血清學(xué)與T細(xì)胞試驗(yàn)可以對(duì)麻風(fēng)病進(jìn)行早期診斷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將患者活檢組織材料接種到小鼠足墊中，然后觀察小鼠發(fā)病情況。三、微生物學(xué)檢驗(yàn)臨床病例學(xué)習(xí)這