臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)：厭氧菌

厭氧菌anaerobicbacteria掌握厭氧菌的種類(lèi)、標(biāo)本要求、實(shí)驗(yàn)室檢查掌握常見(jiàn)厭氧芽孢梭菌的生物學(xué)特征重點(diǎn)概述一、厭氧菌的概念、種類(lèi)與人體分布：概念：對(duì)氧氣敏感，一般在有充足氧環(huán)境中不能生長(zhǎng)，無(wú)氧或低氧分壓環(huán)境中才能生長(zhǎng)一類(lèi)細(xì)菌。（缺乏完善的酶系統(tǒng)，只能以無(wú)氧發(fā)酵進(jìn)行能量代謝）分布：自然界廣泛分布，是人體正常菌群，其中口腔、腸道中厭氧菌量最多。

部位

細(xì)菌總數(shù)

比率

(CFU/mlormg)

厭氧菌:需氧菌UpperAirway

鼻洗液

103-104 3-5:1

口水 108-109 1:1

牙齒表面 1010-1011 1:1

牙齦縫隙

1011-1012 1000:1

GastrointestinalTract

胃 102-105 1:1

小腸 102-104 1:1

回腸 104-107 1:1

結(jié)腸 1011-1012 1000:1

FemaleGenitalTract

子宮頸 108-109 3-5:1

陰道 108-109 3-5:1

概述種類(lèi)：1.根據(jù)革蘭染色分類(lèi):

(1)革蘭陽(yáng)性有芽胞桿菌(梭狀芽孢桿菌屬）

破傷風(fēng)芽孢桿菌產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌

肉毒梭狀芽孢桿菌艱難梭狀芽孢桿菌

(2)革蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞桿菌（正常菌群）

乳酸桿菌、雙歧桿菌、優(yōu)桿菌屬、丙酸桿菌屬(3)革蘭陰性無(wú)芽胞桿菌

類(lèi)桿菌屬、普雷沃菌屬、卟啉單胞菌屬、梭桿菌屬(4)革蘭陽(yáng)性厭氧球菌消化球菌屬、消化鏈球菌屬(5)革蘭陰性厭氧球菌韋榮球菌屬2.根據(jù)對(duì)氧耐受程度分類(lèi):對(duì)氧極端敏感的厭氧菌：在0.5%的氧分壓或在空氣中暴露10mins即死亡的細(xì)菌。中度厭氧菌：能在2%--8%的氧分壓環(huán)境中或空氣暴露60mins—90mins或在膿液標(biāo)本中72h還可以分離出來(lái)的細(xì)菌。耐氧厭氧菌：可以在剛配制出來(lái)的固體厭氧培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)不良，無(wú)氧條件下生長(zhǎng)更好的細(xì)菌。二、臨床意義感染普遍，以混合感染為主。內(nèi)源性感染＞外源性，無(wú)芽胞厭氧菌＞芽胞厭氧菌感染危險(xiǎn)因素（條件）

1.局部組織血液供給障礙：局部缺氧

2.機(jī)體局部屏障作用破壞：組織氧張力↓

3.機(jī)體免疫功能↓

4.長(zhǎng)期應(yīng)用氨基糖苷類(lèi)等藥物可誘發(fā)厭氧菌感染二、臨床意義厭氧菌感染的臨床及細(xì)菌學(xué)指征：1.局部氣體產(chǎn)生2.深部外傷感染3.有惡臭的分泌物4.口腔、胃腸和生殖道手術(shù)后感染、流產(chǎn)后發(fā)生的感染，常規(guī)血培養(yǎng)陰性的心內(nèi)膜炎，并發(fā)膿毒癥血栓靜脈炎等5.其它：鏡檢有菌而培養(yǎng)陰性，或在液體及半固體培養(yǎng)基深部長(zhǎng)的細(xì)菌等

臨床標(biāo)本肉眼觀察分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)及直接鏡檢厭氧培養(yǎng)

2-7d確定厭養(yǎng)培養(yǎng)

需氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)生長(zhǎng)無(wú)生長(zhǎng)生長(zhǎng)

兼性厭氧菌專性厭氧菌保存菌種分類(lèi)鑒定藥物敏感試驗(yàn)形態(tài)與染色菌落特性生化反應(yīng)藥敏性鑒定氣液相色譜厭氧菌的檢驗(yàn)引起人類(lèi)疾病的各種常見(jiàn)梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）

細(xì)菌名稱所致疾病破傷風(fēng)梭菌破傷風(fēng)產(chǎn)氣莢膜梭菌氣性壞疽、毒血癥、壞死性腸炎、食物中毒等肉毒梭菌食物中毒、嬰兒肉毒梭菌癥、創(chuàng)傷肉毒癥艱難梭菌抗生素相關(guān)性腹瀉、抗生素相關(guān)性偽膜性腸炎厭氧菌中唯一有芽孢菌屬厭氧或微需氧的粗大革蘭陽(yáng)性桿菌。廣泛分布在自然界。

梭狀芽胞桿菌屬（一）臨床意義致病因素--痙攣毒素（外毒素），臨床癥狀:牙關(guān)緊閉角弓反張等

一、破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）下列情況易致破傷風(fēng)梭菌感染傷口窄而深（如刺傷），有泥土或異物污染大面積創(chuàng)傷、燒傷，壞死組織多，局部組織缺血有需氧菌或兼性厭氧菌混合感染的傷口無(wú)侵襲力，僅在局部繁殖，外毒素致病1.對(duì)氧敏感的破傷風(fēng)溶血毒素(tetanolysin)2.質(zhì)粒編碼的破傷風(fēng)痙攣毒素(tetanospasmin)屬神經(jīng)毒(neurotoxin)，毒性極強(qiáng)(對(duì)人致死量<1μg)蛋白質(zhì)（可脫毒成類(lèi)毒素），不耐熱：輕鏈（A鏈）-S-S-重鏈（B鏈）

B鏈：神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的單位

A鏈：毒性作用致病因子

(二)生物學(xué)性狀

1.形態(tài)染色:革蘭陽(yáng)性芽胞圓形，比菌體大，位于菌體頂端呈鼓槌狀，無(wú)莢膜，有鞭毛。

2.培養(yǎng)特性:專性厭氧，在血平板上有遷徙生長(zhǎng)，菌落呈羽毛狀。庖肉培養(yǎng)基輕度變濁，肉渣部分消化，微變黑，惡臭，產(chǎn)少量氣體。(三)微生物學(xué)檢查

癥狀典型者，一般不作細(xì)菌檢查。懷疑感染：直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、鑒定鑒別3.生化反應(yīng)：不發(fā)酵分解糖類(lèi)，硝酸鹽－，H2S＋，

明膠＋4.抵抗力：芽胞耐熱、耐干燥，對(duì)青霉素、紅霉素、四環(huán)素等敏感，氨基糖苷類(lèi)耐藥。二、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（C.perfringens）1.莢膜、外毒素和侵襲性酶類(lèi)－引起氣性壞疽

的臨床表現(xiàn)

（水腫、皮下捻發(fā)音）

α毒素（卵磷脂毒素）產(chǎn)生量最大引起血管通透性增加伴大量溶血、組織壞死、肝臟、心功能受損在氣性壞疽的形成中起主要作用β、γ、ε等其他毒素引起組織壞死、血管通透性增加、水腫、產(chǎn)氣（一）臨床意義2.腸毒素－食物中毒（壞死性腸炎）。下列情況易導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌感染：開(kāi)放性骨折大塊肌肉撕裂組織嚴(yán)重壞死

（二）生物學(xué)性狀

1.形態(tài)染色：革蘭陽(yáng)性粗短大桿菌，兩端鈍圓，芽胞圓形位于菌體中央或次極端，直徑不大于菌體，但較少形成，有莢膜，無(wú)鞭毛。

2.培養(yǎng)特性：非嚴(yán)格厭氧，繁殖迅速，血平板上雙層溶血環(huán)，皰肉培養(yǎng)基中“洶涌發(fā)酵”。3.生化反應(yīng)：H2S＋，明膠＋，葡萄糖＋，乳糖＋，麥芽糖＋，蔗糖＋，卵磷脂酶＋

卵磷脂酶陽(yáng)性（三）微生物學(xué)檢查法直接涂片鏡檢深部創(chuàng)口取材涂片革蘭陽(yáng)性大桿菌白細(xì)胞少且不典型伴有其他雜菌早期診斷可避免病人最終截肢或死亡

分離培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)接種血平板或庖肉培養(yǎng)基，鏡檢及生化反應(yīng)鑒定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如懷疑食物中毒，在發(fā)病后一日內(nèi)，檢出大于105CFU/克食品或106CFU/克糞便可確立診斷三、肉毒梭菌（C.botulinum

[,bɑt??'la?n?m]）（一）生物學(xué)性狀：1.形態(tài)染色：革蘭陽(yáng)性大桿菌,芽胞橢圓形位于菌體次極端,比菌體粗,呈網(wǎng)球拍狀。無(wú)莢膜,有鞭毛。2.培養(yǎng)特性：嚴(yán)格厭氧，普通培養(yǎng)基生長(zhǎng)，血平板上β溶血環(huán)，庖肉培養(yǎng)基肉渣消化，變黑，惡臭。3.生化反應(yīng)：H2S＋,明膠＋,葡萄糖＋,麥芽糖＋,乳糖－,

吲哚－,卵磷脂酶－

（二）臨床意義肉毒毒素--毒性極強(qiáng)嗜神經(jīng)性，使神經(jīng)麻痹；食物中毒。劇毒（對(duì)人致死量為0.1μg)（三）微生物學(xué)檢查

毒素檢測(cè)和分離培養(yǎng)鑒定四、艱難梭菌（一）生物學(xué)性狀：1.形態(tài)染色：革蘭陽(yáng)性大桿菌，芽胞橢圓形或長(zhǎng)方形，位于菌體次極端不大于菌體，無(wú)莢膜，有鞭毛。2.培養(yǎng)特性：嚴(yán)格厭氧，血平板無(wú)溶血環(huán)，CCFA平板呈黃色菌落，在紫外燈下可見(jiàn)黃綠熒光。3.生化反應(yīng)：H2S－,蔗糖－,葡萄糖＋,乳糖－,麥芽糖－,

吲哚－,脂酶－（二）臨床意義正常菌群。醫(yī)院感染的重要病原菌。產(chǎn)生A、B兩種毒素，即腸毒素和細(xì)胞毒素，引起假膜性腸炎。（三）微生物學(xué)檢查

毒素檢測(cè)和分離培養(yǎng)鑒定艱難梭菌在CCFA平板上菌落（培養(yǎng)48h)

革蘭陰性無(wú)芽胞厭氧桿菌臨床厭氧菌感染中最常見(jiàn)的病原菌一、類(lèi)桿菌屬

BBE平板上有黑色暈圈二、普雷沃菌屬

KVLB出現(xiàn)黑色菌落三、卟啉單胞菌屬四、梭桿菌屬

革蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞厭氧桿菌革蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞厭氧桿菌有6個(gè)屬，幾十個(gè)菌種，臨床常見(jiàn)的有丙酸桿菌、優(yōu)桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、蛛網(wǎng)菌和放線菌。它們多是人和動(dòng)物皮膚、口腔、腸道等部位的重要生理菌群，在體內(nèi)起到調(diào)節(jié)和維持人體微生態(tài)平衡的重要作用。它們的菌落、生化反應(yīng)、菌體形態(tài)等都很相似，鑒定較難。應(yīng)用氣液相色譜法（GLC），根據(jù)其代謝產(chǎn)物不同，可對(duì)菌屬做出初步判定。厭氧球菌厭氧性球菌(Anaerobiccocci)是臨床厭氧感染的重要病原菌，約占臨床厭氧菌分離株的25％主要包括革蘭陽(yáng)性:消化球菌屬消化鏈球菌屬

革蘭陰性:韋榮球菌屬消化球菌屬黑色消化球菌(Peptococcusniger)是消化球菌屬中唯一的菌種。革蘭陽(yáng)性球菌。直徑0.3～1.3μm，單個(gè)、成雙、短鏈或成堆排列。無(wú)芽胞，無(wú)莢膜。專性厭氧菌，生長(zhǎng)緩慢，厭氧培養(yǎng)2～4天形成黑色不溶血的小菌落。標(biāo)本黑色有臭味是該細(xì)菌感染的重要特點(diǎn)。

消化鏈球菌屬代表菌為厭氧消化鏈球菌（P.anaerobius）革蘭陽(yáng)性球形或卵圓形，大小不等，菌體直徑0.3～1μm，常成雙或呈短鏈狀排列。無(wú)鞭毛，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜。消化鏈球菌培養(yǎng)特性專性厭氧，營(yíng)養(yǎng)要求較高，需羊血和血清培養(yǎng)基才能生長(zhǎng)。在厭氧血平板上，菌落直徑0.5～1mm、灰白色、凸起、不透明、邊緣整齊，一般不溶血，偶有α或β溶血。生化反應(yīng)不活潑，在硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中，呈顆粒狀沉淀生長(zhǎng)。在其平板上生化反應(yīng)較為明顯，吐溫-80可促進(jìn)其生長(zhǎng)。韋榮球菌屬

韋榮球菌屬細(xì)菌形態(tài)相似，為革蘭陰性球菌。直徑0.3～0.5μm，多排列成對(duì)、近似奈瑟球菌。無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞。專性厭氧，血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)48h后，形成直徑1～2mm圓形、凸起、灰白色或黃色混濁、不溶血菌落；在硫乙醇酸鹽肉湯中混濁生長(zhǎng)，產(chǎn)生小氣泡。新鮮培養(yǎng)物立即置紫外線下照射，菌落可顯紅色熒光，接觸空氣后熒光消失。生化反應(yīng)不活潑，不分解糖類(lèi)，還原硝酸鹽。革蘭陰性無(wú)芽胞厭氧桿菌這是一群不形成芽胞的厭氧桿菌，是人體正常菌群的重要組成成員，部分菌株可作為條件致病菌引起感染。常見(jiàn)菌屬有：類(lèi)桿菌屬普雷沃菌屬卟啉（紫）單胞菌屬梭桿菌屬類(lèi)桿菌屬類(lèi)桿菌屬(Bacteroides)是臨床上最重要的革蘭陰性無(wú)芽胞厭氧桿菌，臨床標(biāo)本中以脆弱類(lèi)桿菌（B.fragilis）最常見(jiàn)。脆弱類(lèi)桿菌為革蘭陰性，大小為(0.8～1.3μm)×(1.6～8μm)，著色不均，兩端鈍圓而濃染，中間不著色染色較淺似空泡。在陳舊培養(yǎng)物或含糖的液體培養(yǎng)基中呈明顯多形性，無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞，多數(shù)有莢膜。普雷沃菌屬普雷沃菌屬(Prevotella)是從類(lèi)桿菌屬分出的一個(gè)新菌屬，代表菌種是產(chǎn)黑色素普雷沃菌(P.melaninogenica)。革蘭陰性球桿狀，大小約0.8～1.5μm×1.0～3.5μm，排列成雙或短鏈，兩端鈍圓，有濃染和空泡。產(chǎn)黑色素普雷沃菌培養(yǎng)特性專性厭氧菌，在厭氧平板上2～3天培養(yǎng)后，菌落直徑為0.5～3mm，圓形、凸起、不透明，許多菌株呈β-溶血。菌落在紫外光（波長(zhǎng)366nm）照射下有磚紅色熒光，逐漸轉(zhuǎn)為褐黑色和棕色菌落，5～7天轉(zhuǎn)為黑色菌落，色素出現(xiàn)后熒光即消失。卟啉（紫）單胞菌屬

紫單胞菌屬(Porphyromonas)又稱卟啉單胞菌屬。代表菌種是不解糖紫單胞菌。革蘭陰性桿菌或球桿菌，大小約1.5～3.5μm×0.8～1.5μm，兩端鈍圓，著色不均勻。35～37℃厭氧培養(yǎng)3～5d可形成1～2mm圓形、凸起、表面光滑、邊緣整齊、棕色或黑色菌落。維生素K1和氯化血紅素可促進(jìn)本菌生長(zhǎng)及黑色素的產(chǎn)生。梭桿菌屬

梭桿菌屬（Fusobacterium）是臨床常見(jiàn)的革蘭陰性無(wú)芽胞厭氧桿菌，形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，兩端尖細(xì)如梭。壞死梭桿菌是毒力很強(qiáng)的梭桿菌，常引起急性扁桃體炎，有時(shí)并發(fā)單核細(xì)胞增多癥，是兒童和青年人扁桃體周?chē)撃[中最常分離到的厭氧菌。局部癥狀還包括頸間隙感染和頸靜脈膿毒性血栓靜脈炎，尚可引起胸膜滲出性膿胸、增生性轉(zhuǎn)移膿腫和菌血癥。壞死梭桿菌形態(tài)習(xí)題關(guān)于厭氧菌，錯(cuò)誤的是

A采集時(shí)注意不被正常菌群污染，盡量避免接觸空氣

B產(chǎn)氣莢膜梭在強(qiáng)化血平板上出現(xiàn)雙層溶血環(huán)

C美藍(lán)指示劑在有氧時(shí)變藍(lán)色

D齒齦、咽喉拭子、痰液或氣管吸出物等標(biāo)本不宜厭氧培養(yǎng)

E局部組織的氧化還原電勢(shì)上升有利厭氧菌生長(zhǎng)EThankyou

標(biāo)本采集原則：采集時(shí)注意不被正常菌群污染，盡量避免接觸空氣下列易污染標(biāo)本不宜厭氧培養(yǎng)齒齦、咽喉拭子，痰液（呼吸道），胃和腸道內(nèi)容物或肛拭子、糞便（消化道），陰道或?qū)m頸拭子（生殖道），中段尿或?qū)蛞海谀虻溃?，皮膚表面或傷口邊緣等標(biāo)本適合厭氧菌檢測(cè)的標(biāo)本：①一級(jí)標(biāo)本：正常無(wú)菌性體液標(biāo)本或活檢標(biāo)本②二級(jí)標(biāo)本：氣管引流液、支氣管灌洗液、膀胱穿刺液等。③三級(jí)標(biāo)本：人體口腔、腸道等有固有菌群存在部位附近感染性膿腫穿刺液等。不同部位標(biāo)本采集法針筒抽取、穿刺術(shù)等

厭氧標(biāo)本運(yùn)送即送即檢，避免標(biāo)本干燥、接觸空氣和低溫保存1.針筒運(yùn)送法：各種液體標(biāo)本，簡(jiǎn)便易行2.無(wú)菌厭氧袋法：注射器、組織標(biāo)本3.已排氣不含氧的管或瓶（內(nèi)含厭氧指示劑）：

檢驗(yàn)方法分離培養(yǎng)1.初代培養(yǎng)：

1）培養(yǎng)基：新鮮、預(yù)還原

非選擇性培養(yǎng)基：強(qiáng)化BAP(血、維生素、氯化血紅素等),幾乎所有厭氧菌均可生長(zhǎng)。

選擇培養(yǎng)基：KVLB、BBE、EYA、CCFA…

2）標(biāo)本接種固體和液體培養(yǎng)基同時(shí)接種

檢驗(yàn)方法3）培養(yǎng)方法

4）結(jié)果觀察

2.次代培養(yǎng)和厭氧菌再確定

3.厭氧菌培養(yǎng)失誤的原因

采集運(yùn)送培養(yǎng)基厭氧環(huán)境時(shí)間等因素

厭氧罐培養(yǎng)法厭氧氣袋培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)法厭氧罐法－以物理或化學(xué)方法造成無(wú)氧環(huán)境

美藍(lán)指示劑（有氧藍(lán)色、無(wú)氧無(wú)色）刃天青指示劑（有氧紅色、無(wú)氧無(wú)色）抽氣換氣法：

10%H2、10%CO2、80%N2、鈀粒

冷觸媒法：

鈀粒硼氫化鉀、碳酸氫鈉、枸櫞酸藥片C2O+H2↑

H2O

O2

氣袋法：

原理同上冷觸媒法，簡(jiǎn)單方便。

厭氧手套箱：

最好的厭氧菌培養(yǎng)設(shè)備

其他：

OxyplatesTM（氧凈）厭氧培養(yǎng)皿－－可反復(fù)打開(kāi)，Oxyrase酶系統(tǒng)能使培養(yǎng)基中O2去除，并產(chǎn)生CO2。

鑒定試驗(yàn)

形態(tài)與染色：

用24h內(nèi)幼齡菌，多染色性，多形性菌落性狀：

色素、溶血、熒光等生化試驗(yàn)：糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)等

抗生素敏感鑒定：

滅滴靈（厭氧菌S）、卡那霉素（梭桿S）、萬(wàn)古霉素等鑒定試驗(yàn)氣液相色譜技術(shù)（GLC）厭氧菌產(chǎn)生大量的有機(jī)酸（揮發(fā)性和非揮發(fā)性脂肪酸），過(guò)柱分析，定性定量。厭氧菌快速發(fā)酵試驗(yàn)：

利用厭氧菌產(chǎn)生的胞外酶與少量的生化基質(zhì)迅速反應(yīng)，4h內(nèi)可觀察到生化反應(yīng)結(jié)果。無(wú)需厭氧環(huán)境，只需濃厭氧菌液即可。質(zhì)譜技術(shù)藥物敏感試驗(yàn)

考慮做厭氧菌體外藥敏試驗(yàn)的臨床情況：①明確厭氧菌