固定化酶和固定化細(xì)胞

固定化酶和固定化細(xì)胞第1頁(yè)/共89頁(yè)4.4固定化活細(xì)胞利用胞內(nèi)酶制作固定化酶時(shí)，先要把細(xì)胞破碎，才能將里面的酶提取出來(lái)，這就增加了工序和成本，且提取的酶往往不夠穩(wěn)定。因此人們?cè)O(shè)想直接固定那些含有所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞，并且就用這樣的細(xì)胞來(lái)催化化學(xué)反應(yīng)。20世紀(jì)70年代，在固定化酶的基礎(chǔ)上科學(xué)家們研制成固定化細(xì)胞（ImmobilizedCell），并且用于生產(chǎn)。70年代末，法國(guó)研究成功固定化細(xì)胞生產(chǎn)啤酒，80年代初我國(guó)居乃琥等用固定化細(xì)胞批量生產(chǎn)啤酒和酒精取得重要研究成果。第2頁(yè)/共89頁(yè)固定化細(xì)胞按其生理狀態(tài)又可分為固定化死細(xì)胞和活細(xì)胞兩大類(lèi)。最初固定化的細(xì)胞是死細(xì)胞或靜止態(tài)細(xì)胞，只利用其酶活性，近年來(lái)發(fā)展到固定化活細(xì)胞。前者經(jīng)固定化后，雖然整個(gè)細(xì)胞活力消失，但是，需要利用的“目的酶”仍保持催化活力；而后者經(jīng)固定化后，細(xì)胞仍保存活性，能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，所以稱(chēng)為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。例如，瓊脂包埋的酵母細(xì)胞數(shù)初時(shí)為106個(gè)/m3，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基里培養(yǎng)兩天后，細(xì)胞數(shù)可達(dá)109～1010個(gè)/m3。第3頁(yè)/共89頁(yè)與酶的固定化相比，固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，有效地利用游離細(xì)胞完整的酶系統(tǒng)和細(xì)胞膜的選擇通透性，既具有固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，又具有其自身的優(yōu)越性：第4頁(yè)/共89頁(yè)①無(wú)需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本；②可進(jìn)行多酶反應(yīng)，且不需添加輔助因子，固定化細(xì)胞不僅可以作為單一的酶發(fā)揮作用，而且可以利用菌體中所含的復(fù)合酶系完成一系列的催化反應(yīng)，對(duì)于這種多酶系統(tǒng)，輔助因子再生容易；固定化細(xì)胞的優(yōu)越性第5頁(yè)/共89頁(yè)③對(duì)于活細(xì)胞來(lái)說(shuō)，保持了酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對(duì)污染的抵抗力更強(qiáng)；④細(xì)胞生長(zhǎng)停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等等。正是由于固定化細(xì)胞的這些無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，盡管其出現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于固定化酶，但其應(yīng)用范圍比固定化酶更為廣泛。固定化細(xì)胞的優(yōu)越性第6頁(yè)/共89頁(yè)當(dāng)然，固定化細(xì)胞也有其自身的缺點(diǎn)，如：必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度；必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)目的酶的分解；胞內(nèi)多酶的存在，會(huì)形成副產(chǎn)物；載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會(huì)造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙等。固定化酶和固定化細(xì)胞都是以酶的應(yīng)用為目的，其制備方法也基本相同。固定化活細(xì)胞的制備條件比固定化酶更要溫和，其制備方法主要有物理吸附法和包埋法兩種。第7頁(yè)/共89頁(yè)4.5酶催化反應(yīng)器及其類(lèi)型以酶為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需要的設(shè)備稱(chēng)之為酶催化反應(yīng)器，簡(jiǎn)稱(chēng)酶反應(yīng)器。第8頁(yè)/共89頁(yè)4.5.1酶反應(yīng)器的類(lèi)型酶反應(yīng)器有兩種類(lèi)型：一類(lèi)是直接用游離酶進(jìn)行反應(yīng)，即均相酶反應(yīng)器；另一類(lèi)是應(yīng)用固定化酶進(jìn)行的非均相酶反應(yīng)器。均相酶反應(yīng)能在批量式攪拌桶反應(yīng)器或超濾膜反應(yīng)器中進(jìn)行，而非均相酶反應(yīng)則可在多種反應(yīng)器中進(jìn)行，適用于連續(xù)催化反應(yīng)，包括：連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、連續(xù)攪拌桶-超濾和循環(huán)式反應(yīng)器等。第9頁(yè)/共89頁(yè)4.5.2反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

第10頁(yè)/共89頁(yè)這類(lèi)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)，主要應(yīng)用在飲料等食品工業(yè)中。其缺點(diǎn)是操作麻煩，在反復(fù)回收過(guò)程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少采用。但是，常用于游離酶。圖4-2批量式攪拌桶反應(yīng)器4.5.2.1批量式攪拌桶反應(yīng)器第11頁(yè)/共89頁(yè)這種反應(yīng)器在運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中，底物以恒定的流速流入反應(yīng)器，與此同時(shí)，反應(yīng)液則以同樣的流速流出反應(yīng)器。反應(yīng)桶內(nèi)裝有攪拌器，使反應(yīng)組分與固定化酶顆?；旌暇?，出口處有過(guò)濾膜，可使不斷補(bǔ)充新鮮底物與反應(yīng)液流量維持動(dòng)態(tài)平衡，如圖4-3。4.5.2.2連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器(ContinuousFlowStirredTandReactor，縮寫(xiě)CSTR)圖4-3連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器第12頁(yè)/共89頁(yè)在理想的連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器中，反應(yīng)液混合良好，各部位的成分相同，并與流出液的組成也一致。CSTR的開(kāi)放結(jié)構(gòu)使得調(diào)換固定化酶比較容易，而且有利于控制溫度和調(diào)節(jié)pH，還能夠處理膠態(tài)或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用CSTR有較高的轉(zhuǎn)化率。第13頁(yè)/共89頁(yè)其缺點(diǎn)是，由攪拌產(chǎn)生的剪切力較大，易打碎磨損固定化酶顆粒。近來(lái)對(duì)此類(lèi)型反應(yīng)器進(jìn)行了改良，就是將載有酶的圓片聚合物固定在攪拌軸上或者放置在與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動(dòng)的金屬網(wǎng)筐內(nèi)，這樣，既能保證反應(yīng)液攪拌均勻，同時(shí)又不致?lián)p壞固定化酶。第14頁(yè)/共89頁(yè)4.5.2.3填充床反應(yīng)器(PackedBedReactor，縮寫(xiě)PBR)圖4-4填充床反應(yīng)器第15頁(yè)/共89頁(yè)填充床反應(yīng)器又稱(chēng)固定床反應(yīng)器（如圖4-4）?？商畛涠嘞虍愋园胪感灾锌绽w維制成管狀，內(nèi)部填充酶膜、酶片等。在填充床反應(yīng)器內(nèi)，底物在一定方向上以恒定的速度通過(guò)固定化酶柱。若柱的橫截面上每一點(diǎn)液體流動(dòng)的速度完全相同，則可以認(rèn)為反應(yīng)器是在理想條件下作為活塞式流動(dòng)反應(yīng)器（PlugFlowReactor，PFR）運(yùn)轉(zhuǎn)。由于流動(dòng)方向上存在速度和溫度梯度，在軸方向上存在底物的擴(kuò)散，所以實(shí)際上總是不可能完全符合理想化的條件。第16頁(yè)/共89頁(yè)4.5.2.4

流化床反應(yīng)器(FluidzedBedReactor，縮寫(xiě)為FBR)圖4-5流化床反應(yīng)器第17頁(yè)/共89頁(yè)流化床型反應(yīng)器是—種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器。反應(yīng)時(shí)，底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器底部向上通過(guò)固定化酶柱床，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。其結(jié)構(gòu)如圖4-5。其流動(dòng)方式使反應(yīng)液的混合程度介于CSTR的全混型和PFR的平推流型之間。由于反應(yīng)器內(nèi)混合程度高，因此，傳熱、傳質(zhì)情況良好。第18頁(yè)/共89頁(yè)4.5.2.5連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器(CSTR／UF)圖4-6連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器第19頁(yè)/共89頁(yè)CSTR／UF結(jié)構(gòu)是CSTR與超濾裝置聯(lián)用的酶膜反應(yīng)器。在CSTR出口處設(shè)置一個(gè)超濾裝置，通過(guò)超濾裝置，酶可以循環(huán)使用。其結(jié)構(gòu)如圖5-6。該超濾器中的半透性超濾膜只允許小分子產(chǎn)物通過(guò)，不允許大分子酶和底物通過(guò)。因此，可以將小分子產(chǎn)物與大分子酶和底物分開(kāi)，有利于產(chǎn)物回收。該反應(yīng)器適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。第20頁(yè)/共89頁(yè)對(duì)這類(lèi)反應(yīng)器在技術(shù)上的可行性已得到了證實(shí)，例如進(jìn)行纖維素的連續(xù)糖化、用α-淀粉酶水解淀粉、用轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖和用青霉素酶把青霉素G轉(zhuǎn)化成6-氨基青霉烷酸（6-APA）等生化過(guò)程。此外，還用于小分子產(chǎn)物（葡萄糖、麥芽糖）與大分子底物（淀粉、纖維素）的分離。第21頁(yè)/共89頁(yè)4.5.2.6

循環(huán)反應(yīng)器（RecycleReactor，RCR）外循環(huán)反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器

循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸機(jī)會(huì)，以達(dá)到所需的轉(zhuǎn)化率。這種反應(yīng)器可用于難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。第22頁(yè)/共89頁(yè)

4.5.3膜式反應(yīng)器膜式反應(yīng)器是20世紀(jì)70年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型反應(yīng)器，它是利用膜的分離功能，同時(shí)完成反應(yīng)和分離過(guò)程的一種反應(yīng)器。第23頁(yè)/共89頁(yè)4.5.3.1膜式反應(yīng)器的類(lèi)型根據(jù)酶的存在狀態(tài)、相數(shù)、膜組件型式、膜材料類(lèi)型、耦合方式、傳質(zhì)推動(dòng)力等的不同，酶膜反應(yīng)器有不同的分類(lèi)方式。根據(jù)膜組件的型式不同，可把酶膜反應(yīng)器分為板框式、螺旋卷式、管式和中空纖維式酶膜反應(yīng)器。以下以螺旋卷膜式反應(yīng)器和中空纖維膜式反應(yīng)器為例來(lái)說(shuō)明。第24頁(yè)/共89頁(yè)（1）螺旋卷膜式反應(yīng)器此反應(yīng)器的螺旋結(jié)構(gòu)是將含酶的膜片與支持材料交替地纏繞在中心棒上。所用的膜片一般是膠原蛋白；而支持材料則是一種稱(chēng)為凡克塞(vexar)的惰性聚合網(wǎng)狀物。后者可以將相鄰的兩層含酶膜片分開(kāi)來(lái)，以防止膜層相互重疊，堵塞流道。把上述螺旋元件裝進(jìn)圓筒，筒兩端加蓋板，并安裝進(jìn)出口管，這樣，就制成了螺旋卷膜式反應(yīng)器。第25頁(yè)/共89頁(yè)含酶的膜是半透性膜，只允許小分子的底物和產(chǎn)物通過(guò)膜，而大分子酶則不能通過(guò)。該反應(yīng)器有許多優(yōu)點(diǎn)，例如，螺旋模型可將流體流動(dòng)的單元分隔成許多獨(dú)立空間，當(dāng)?shù)孜锶芤毫鹘?jīng)各個(gè)獨(dú)立空間，并與酶接觸時(shí)，均有相同的流體力學(xué)條件和停留時(shí)間，可改善接觸效果，消除短路；另外，網(wǎng)狀支持材料可以提高每一流動(dòng)間隔的混合效果，加快物質(zhì)傳遞。第26頁(yè)/共89頁(yè)（2）中空纖維膜式反應(yīng)器這類(lèi)反應(yīng)器是把酶結(jié)合于半透性的中空纖維上，中空纖維壁的內(nèi)外結(jié)構(gòu)一般是不同的。其內(nèi)層是緊密光滑的半透性膜，有一定的分子截留值，可以截留大分子物質(zhì)如酶，而允許小分子物質(zhì)通過(guò)。其外層是多孔海綿狀的支持層。將酶固定于中空纖維的支持層中，然后，將許多含酶的中空纖維集中成－束，裝進(jìn)圓筒內(nèi)，筒兩端封閉，并安裝進(jìn)出口管道，這樣便制成了中空纖維膜式反應(yīng)器。第27頁(yè)/共89頁(yè)用這種固定化酶填充的反應(yīng)器可以提供較大的催化表面，其缺點(diǎn)是中空纖維的制造極為困難，難以保證纖維束內(nèi)流體流動(dòng)的均勻性，以及存在較大的物質(zhì)傳遞阻力等。第28頁(yè)/共89頁(yè)4.5.3.2膜式反應(yīng)器的特點(diǎn)與一般反應(yīng)器相比，酶膜反應(yīng)器具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不受化學(xué)平衡轉(zhuǎn)化率的限制，這是酶膜反應(yīng)器最為顯著的特點(diǎn)之一。許多重要的化學(xué)反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，使用傳統(tǒng)的反應(yīng)器無(wú)法突破平衡轉(zhuǎn)化率的限制。而在膜反應(yīng)器中，膜的選擇透過(guò)性可使某些組分(如產(chǎn)物)的連續(xù)脫除成為可能，從而可促使化學(xué)平衡發(fā)生移動(dòng)，大大提高了反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。第29頁(yè)/共89頁(yè)（2）酶膜反應(yīng)器可將目的產(chǎn)物分離出去，而酶可以重復(fù)利用，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，并有可能提高復(fù)雜反應(yīng)的選擇性。（3）膜作為酶的固定化載體可以使酶在類(lèi)似生物膜的環(huán)境中高效發(fā)揮作用。第30頁(yè)/共89頁(yè)（4）可實(shí)現(xiàn)對(duì)流傳質(zhì)代替自由擴(kuò)散，強(qiáng)化了傳質(zhì)速率，提高了反應(yīng)速率。填充床與流化床反應(yīng)器中，質(zhì)量傳遞常會(huì)因分子擴(kuò)散的制約而影響反應(yīng)的進(jìn)程，而酶膜反應(yīng)器可通過(guò)對(duì)流擴(kuò)散消除這種影響，從而使傳質(zhì)速率加快，反應(yīng)速度提高。第31頁(yè)/共89頁(yè)（5）可以簡(jiǎn)化工藝流程和操作步驟，有可能使產(chǎn)物分離、反應(yīng)物凈化及化學(xué)反應(yīng)等幾個(gè)單元操作在一個(gè)膜反應(yīng)器中進(jìn)行，從而可以同時(shí)起到降低生產(chǎn)成本和增加產(chǎn)量的作用。（6）膜作為相分離器和相接觸器，避免了乳化和破乳等問(wèn)題，也擺脫了液泛的限制。第32頁(yè)/共89頁(yè)但是膜反應(yīng)器在使用過(guò)程中也存在著一些問(wèn)題，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了膜反應(yīng)器的推廣應(yīng)用：由于膜的加工水平較低，膜孔分布與形態(tài)結(jié)構(gòu)的均一性差，造成酶分子和小分子激活劑(金屬離子或輔助因子等)的泄漏損失，需要在酶促反應(yīng)過(guò)程中不斷添加，既增加成本又造成操作過(guò)程的復(fù)雜化。第33頁(yè)/共89頁(yè)酶在膜表面的隨機(jī)吸附引起酶空間構(gòu)型的改變或活性位點(diǎn)的遮蔽，有些膜材料還可使酶中毒失活，從而降低或破壞酶的催化活性。酶分子在酶膜反應(yīng)器中容易因湍流等原因而發(fā)生剪切失活。第34頁(yè)/共89頁(yè)有些情形下，由于產(chǎn)物分子在靠近膜面的位置逐漸積聚而形成凝膠層，造成酶膜反應(yīng)器中嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制降低了生產(chǎn)效率。濃差極化和膜污染使酶膜反應(yīng)器的傳質(zhì)速率和生產(chǎn)能力急劇下降，膜孔堵塞、膜厚增加使膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生不利變化，膜需要頻繁地清洗或更換。第35頁(yè)/共89頁(yè)4.5.3.3膜式反應(yīng)器的應(yīng)用酶膜反應(yīng)器把酶促反應(yīng)與膜的選擇性物質(zhì)傳遞有效地結(jié)合在一起，從而創(chuàng)造出有利的過(guò)程熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)，在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)境等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。目前膜反應(yīng)器的應(yīng)用主要有：輔酶或輔助因子的再生、有機(jī)相酶催化、手性拆分與手性合成、反膠團(tuán)中的酶催化、生物大分子的水解等。第36頁(yè)/共89頁(yè)其在食品中的應(yīng)用如：①透過(guò)果膠水解來(lái)降低果汁粘度；②通過(guò)將乳糖轉(zhuǎn)化為可以消化的糖類(lèi)來(lái)降低牛奶和乳清中乳糖的含量；③通過(guò)多酚化合物和花色素的轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行白酒的處理；④從牛奶產(chǎn)品中去除過(guò)氧化物等。酶膜反應(yīng)器與傳統(tǒng)反應(yīng)器相比，具有許多現(xiàn)實(shí)意義。隨著膜式反應(yīng)器應(yīng)用中一些問(wèn)題的解決，膜式反應(yīng)器將會(huì)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。第37頁(yè)/共89頁(yè)以上各種類(lèi)型的酶反應(yīng)器都可供使用，但并不存在一種通用的理想反應(yīng)器。在酶促反應(yīng)中，反應(yīng)器的選擇是一個(gè)十分重要的問(wèn)題。在選擇反應(yīng)器時(shí)，除應(yīng)考慮固定化酶的形狀及穩(wěn)定性、底物與產(chǎn)物性質(zhì)和載體性質(zhì)外，還需考慮生產(chǎn)成本、操作方式及反應(yīng)器應(yīng)用的可塑性等因素。在生產(chǎn)中，必須根據(jù)具體情況，針對(duì)系統(tǒng)的特點(diǎn)，選擇和使用合適的反應(yīng)器。第38頁(yè)/共89頁(yè)

第5章蛋白酶、溶菌酶

（2學(xué)時(shí)）主要內(nèi)容：5.1蛋白酶

5.2溶菌酶第39頁(yè)/共89頁(yè)5.1蛋白酶蛋白酶是食品工業(yè)中最重要的一類(lèi)酶。在干酪生產(chǎn)、肉類(lèi)嫩化和植物蛋白質(zhì)改性中都大量使用蛋白酶。人體消化道中存在的胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶使人體攝入的蛋白質(zhì)水解成小分子肽和氨基酸。第40頁(yè)/共89頁(yè)5.1.1蛋白質(zhì)的特異性要求

1、R1和R2基團(tuán)的性質(zhì)：胰凝乳蛋白酶僅能水解R1是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸殘基的側(cè)鏈的肽鍵；胰蛋白酶僅能水解R1是精氨酸或賴(lài)氨酸殘基的側(cè)鏈的肽鍵。胃蛋白酶和羧肽酶對(duì)R2基團(tuán)具有特異性要求，如R2是苯丙氨酸殘基的側(cè)鏈，那么這兩種酶能以最高速度水解肽鍵。第41頁(yè)/共89頁(yè)2、氨基酸構(gòu)型：必須是L型的，天然蛋白質(zhì)均屬L型。3、底物分子大?。簩?duì)于胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，底物分子大小不重要，如前述。第42頁(yè)/共89頁(yè)4、X和Y性質(zhì)：X、Y可以是-H、-OH，也可以繼續(xù)衍生出去。（1）如果是肽鏈內(nèi)切酶，在R1、R2能滿(mǎn)足特異性要求的前提下，肽鏈就能裂開(kāi)，顯然X和Y必須繼續(xù)衍生出去，內(nèi)切酶活力才表現(xiàn)出最高。X、Y可以是氨基酸殘基。（2）對(duì)于肽鏈端解酶的羧肽酶，要求底物中Y是一個(gè)-OH，其特異性對(duì)R2有嚴(yán)格要求。在X不是-H時(shí)，可表現(xiàn)高活力。（3）對(duì)于肽鏈端解酶的氨肽酶，要求底物中X是一個(gè)-H，優(yōu)先選擇Y不是-OH，特異性表現(xiàn)在R1上。第43頁(yè)/共89頁(yè)5、對(duì)肽鍵的要求：大多數(shù)蛋白酶不僅限于水解肽鍵，尚能作用于酰胺（-NH2）、酯（-COOR）、硫羥酸酯（-COSR）和異羥污酸（-CONHOH）胃蛋白酶和其它一些酸性蛋白酶對(duì)水解鍵有較高識(shí)別能力。如肽鍵→脂鍵，即使R2滿(mǎn)足要求也不能作為底物。第44頁(yè)/共89頁(yè)5.1.2蛋白酶分類(lèi)：1、來(lái)源：（1）植物：菠蘿、木瓜、無(wú)花果（2）動(dòng)物：胃、胰蛋白酶、凝乳酶（胃）（3）微生物：1398枯草桿菌、3942棲土曲霉蛋白酶、放線(xiàn)菌蛋白酶2、最適作用條件：（1）中性蛋白酶：pH6~81398枯草桿菌、3942棲土曲霉蛋白酶（2）堿性蛋白酶：pH9~112709枯草桿菌蛋白酶（3）酸性蛋白酶：pH1~3胃蛋白酶第45頁(yè)/共89頁(yè)3、對(duì)底物作用方式：（1）內(nèi)肽酶：產(chǎn)物為脲、胨、多肽、低肽（2）外肽酶：羧肽酶：從以羧基末端氨肽酶：從氨基末端4、根據(jù)酶活性部位：（1）絲氨酸蛋白酶（2）巰基蛋白酶（木瓜蛋白酶）（3）金屬蛋白酶（4）酸性蛋白酶（凝乳蛋白酶）第46頁(yè)/共89頁(yè)5.1.3木瓜蛋白酶：其酶活性部位中含有巰基，屬巰基蛋白酶。木瓜蛋白酶存在于木瓜汁液中，分子量23900，至少有3個(gè)氨基酸殘基存在于酶的活性部位，它們是Cys25（半胱）、His159（組）和Asp158（天冬）。當(dāng)Cys25被氧化劑氧化或與重金屬離子結(jié)合時(shí)，酶活力被抑制，而還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）或EDTA能恢復(fù)酶的活力。還原劑作用：從-S-S——-SH，EDTA螯合重金屬離子。第47頁(yè)/共89頁(yè)木瓜蛋白酶在pH5時(shí)，有良好穩(wěn)定性，如pH<3或>11時(shí)酶很快失活，最適pH隨底物改變。木瓜蛋白酶具有較高的耐熱性，酶液在pH7和70度下加熱30分鐘，而使牛乳凝結(jié)的活力僅下降20%。木瓜蛋白酶對(duì)酯和酰胺類(lèi)底物表現(xiàn)出很高的活力。第48頁(yè)/共89頁(yè)5.1.4酸性蛋白酶：（重點(diǎn)介紹凝乳蛋白酶）酸性蛋白酶是指蛋白酶具有較低的最適pH，而不是指酸性基團(tuán)存在于酶的活性部位。酶的活性部位含有一個(gè)或更多的羧基。有胃蛋白酶、凝乳酶凝乳酶是存在于哺乳期小牛第四胃中的蛋白酶，以無(wú)活性的酶原形式被分泌出來(lái)。隨著小牛的長(zhǎng)大，由攝取母乳改變成青草和谷物時(shí)，凝乳酶的數(shù)量下降，而胃蛋白酶的數(shù)量增加。第49頁(yè)/共89頁(yè)凝乳酶從無(wú)活性酶原轉(zhuǎn)變成活性酶時(shí)經(jīng)受了部分水解，分子量從36000下降到31000，pH5時(shí)酶原主要通過(guò)自身催化作用激活，而在pH2時(shí)，激活過(guò)程進(jìn)行得非?？臁Ｄ槊冈趐H5.3~6.3最穩(wěn)定，在pH3.5~4.5由于自我消化而失活。在中性和堿性范圍，無(wú)凝乳活力。第50頁(yè)/共89頁(yè)凝乳酶催化酪蛋白沉淀是干酪制造中非常重要的一步。原料乳殺菌——添加發(fā)酵劑、凝乳酶、色素——凝塊形成——排除乳清——切塊、攪拌、加熱（CaCl20.01%）——成型壓榨——腌漬——發(fā)酵成熟——上色掛蠟——成品第51頁(yè)/共89頁(yè)5.1.5蛋白酶水解蛋白質(zhì)的苦味來(lái)源：水解蛋白酶的苦味和蛋白質(zhì)原有的氨基酸組成有關(guān)。特別是蛋白質(zhì)中的疏水性氨基酸是導(dǎo)致蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生苦肽的重要原因。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于天然狀態(tài)時(shí)，這些氨基酸埋藏在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，因而對(duì)蛋白質(zhì)的味道不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響。在酶水解過(guò)程中，小肽的數(shù)量將增加，從而暴露了這些疏水性氨基酸，當(dāng)它們同味蕾相作用時(shí)就產(chǎn)生了苦味。

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如果采取有控制的酶水解，使蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)停止在某一個(gè)階段，使肽鍵具有足夠的長(zhǎng)度將疏水性氨基酸埋藏在它的結(jié)構(gòu)內(nèi)部，就能減少水解蛋白質(zhì)的苦味。第53頁(yè)/共89頁(yè)5.1.6蛋白酶作為食品添加劑的應(yīng)用：1、作為肉類(lèi)嫩化劑多使用木瓜蛋白酶。從宰殺老齡的動(dòng)物得到的肉類(lèi)，經(jīng)燒煮后口感粗糟和堅(jiān)硬。肉類(lèi)中存在一定數(shù)量的膠原蛋白質(zhì)，膠原蛋白質(zhì)中的交聯(lián)數(shù)目和強(qiáng)度隨動(dòng)物年齡的增加而提高。木瓜蛋白酶作用效果從肉類(lèi)感官評(píng)定和剪切力測(cè)定中可以看出。第54頁(yè)/共89頁(yè)適合于配制肉類(lèi)嫩化劑的蛋白酶必須具有較高的耐熱性。這是因?yàn)槟刍瘎┑淖饔弥饕l(fā)生在當(dāng)肉類(lèi)被燒煮，溫度逐漸升高，而酶尚未失活之前的這個(gè)階段。燒煮導(dǎo)致肉類(lèi)結(jié)締組織中膠原蛋白質(zhì)和強(qiáng)性蛋白質(zhì)變性，而蛋白酶較易作用于變性的膠原蛋白質(zhì)和彈性蛋白質(zhì)。木瓜蛋白酶在60~65度時(shí)使膠原蛋白質(zhì)增溶的速度最快。第55頁(yè)/共89頁(yè)2、綠茶飲料渾濁：渾濁物質(zhì)主要是由蛋白質(zhì)（15~65%）和多酚類(lèi)化合物（10~35%），通稱(chēng)茶乳酪（creamy）,是綠茶飲料生產(chǎn)中的關(guān)鍵，添加木瓜蛋白酶除去綠茶浸提液中的蛋白質(zhì)，對(duì)穩(wěn)定綠茶飲料十分有利。第56頁(yè)/共89頁(yè)5.2溶菌酶溶菌酶（N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又稱(chēng)為胞壁質(zhì)酶，是一種專(zhuān)門(mén)作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶。溶菌酶是由129個(gè)氨基酸構(gòu)成的單純堿性球蛋白，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定。在自然界中，溶菌酶普遍存在于鳥(niǎo)類(lèi)、家禽的蛋清和哺乳動(dòng)物的眼淚、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和組織細(xì)胞中(如肝、腎、淋巴組織、腸道等)，從木瓜、蕪青、大麥、無(wú)花果和卷心菜、蘿卜等植物中也能分離出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。第57頁(yè)/共89頁(yè)在生物體內(nèi)溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增強(qiáng)機(jī)體免疫力的生理功能，還可激活血小板，改善組織局部血液循環(huán)障礙，分泌膿液，增強(qiáng)局部防衛(wèi)功能，具有止血、消腫等作用。它還可以作為一種宿主抵抗因子，對(duì)組織局部起保護(hù)作用。第58頁(yè)/共89頁(yè)5.2.1溶菌酶的種類(lèi)溶菌酶的研究最早是從尼科爾(Nicoile)1907年發(fā)表枯草桿菌溶解因子的報(bào)告開(kāi)始的。兩年后，Laschtschenko指出：雞卵白強(qiáng)烈抑菌作用是酶作用的結(jié)果。1922年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明(Fleming)發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在這種能溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶。第59頁(yè)/共89頁(yè)1937年由Abraham與Robinson從卵蛋白中最先分離出晶體溶菌酶，此后人們?cè)谌撕蛣?dòng)物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在，根據(jù)來(lái)源不同，將溶菌酶分為以下三類(lèi)。第60頁(yè)/共89頁(yè)5.2.1.1動(dòng)物源溶菌酶動(dòng)物源溶菌酶包括雞蛋清溶菌酶及人和哺乳動(dòng)物溶菌酶。雞蛋清溶菌酶是目前研究和應(yīng)用最多的，在雞蛋清中約含有3.5%左右的酶，分子量為14000，其等電點(diǎn)在pH10.8左右，最適效應(yīng)溫度在50℃，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，pH在1.2～11.3之間改變時(shí)對(duì)酶結(jié)構(gòu)影響很小，pH在4～7范圍內(nèi)100℃處理1min仍有近100%的活力，在210℃條件下加熱1.5h仍具有活性。第61頁(yè)/共89頁(yè)雞蛋清溶菌酶在堿性環(huán)境條件下穩(wěn)定性較差，分解G+細(xì)菌，但對(duì)G-細(xì)菌不起作用。研究表明其它鳥(niǎo)類(lèi)蛋清溶菌酶也是由129個(gè)氨基酸殘基組成，但其排列順序和雞蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。第62頁(yè)/共89頁(yè)人溶菌酶分子量為14600單位，對(duì)人的溶菌酶研究發(fā)現(xiàn)它是由130個(gè)氨基酸殘基組成，也有4個(gè)S-S鍵，其一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸順序及組成與雞蛋清溶菌酶相比有極大的差異，但三級(jí)結(jié)構(gòu)有相似性，其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高2倍。對(duì)于哺乳動(dòng)物溶菌酶，目前僅從牛、馬、羊等動(dòng)物的乳汁中分離出溶菌酶，其化學(xué)性質(zhì)與人溶菌酶相似，但結(jié)構(gòu)尚不清楚，其溶菌活性遠(yuǎn)低于人溶菌酶。第63頁(yè)/共89頁(yè)5.2.1.2植物源溶菌酶目前發(fā)現(xiàn)含溶菌酶的植物有近170種，在木瓜、無(wú)花果、大麥等植物中均已分離出溶菌酶。植物源溶菌酶分子量較大，約為24000～29000單位，其對(duì)溶壁小球菌的溶菌活性不超過(guò)雞蛋清溶菌酶的1/3，但其對(duì)膠體狀甲殼質(zhì)的分解活性則是雞蛋清溶菌酶的10倍。第64頁(yè)/共89頁(yè)5.2.1.3微生物源溶菌酶上世紀(jì)60年代從微生物中分離出溶菌酶，根據(jù)其作用對(duì)象分為細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶和真菌細(xì)胞壁溶菌酶。細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶可分為三大類(lèi)：N-乙酰氨基己糖苷酶，它破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中β-(1，4)糖苷鍵；酰胺酶，它催化裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸與肽“尾”之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵；內(nèi)肽酶，它催化裂解肽聚糖肽橋中的肽鍵。第65頁(yè)/共89頁(yè)現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶的抗菌活性不僅表現(xiàn)在其分解細(xì)菌細(xì)胞壁方面，當(dāng)酶受到不可逆抑制后，它仍然顯示出抗菌效應(yīng)；不同來(lái)源的細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶有不同的抗菌范圍，并對(duì)不同類(lèi)型的肽聚糖有特異性。第66頁(yè)/共89頁(yè)真菌細(xì)胞壁溶菌酶包括幾丁質(zhì)酶和β-葡聚糖酶?？拐婢膸锥≠|(zhì)酶主要是內(nèi)幾丁質(zhì)酶，首先是在植物中發(fā)現(xiàn)，這類(lèi)幾丁質(zhì)酶可以對(duì)抗侵入植物體的真菌病原體，后來(lái)人們?cè)阪溍咕鷮?、桿菌和大多數(shù)真菌也發(fā)現(xiàn)該酶，真菌幾丁質(zhì)酶與植物幾丁質(zhì)酶相似。幾丁質(zhì)酶主要用于真菌細(xì)胞壁的降解和重組，但在大多數(shù)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的真菌中，此酶主要用于真菌細(xì)胞壁的成型過(guò)程，由于肽聚糖和甲殼質(zhì)的糖骨架具有相似的結(jié)構(gòu)，一些幾丁質(zhì)酶也具有溶菌酶活性。第67頁(yè)/共89頁(yè)β-葡聚糖酶(β-glucanases)是另一類(lèi)真菌細(xì)胞壁溶菌酶，包括β-(1，3)葡聚糖酶，β-(1，6)葡聚糖酶和甘露聚糖酶等，主要用于分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁。如β-(1，3)葡聚糖酶主要作用是它能水解β-(1，3)糖苷鍵，還可以對(duì)幾丁質(zhì)降解真菌細(xì)胞壁起到顯著的協(xié)同作用，將純化的幾丁質(zhì)酶和β-葡聚糖酶合用，其抗灰色葡萄孢(Botrytiscinera)的作用能夠提高10倍。

第68頁(yè)/共89頁(yè)5.2.2溶菌酶的性質(zhì)及作用機(jī)理

溶菌酶純品為白色或微黃、黃色的結(jié)晶體或無(wú)定型粉末，無(wú)異味，微甜，易溶于水，遇堿易被破壞，不溶于乙醚。其活性受以下因素影響。第69頁(yè)/共89頁(yè)5.2.2.1溫度對(duì)溶菌酶活性的影響Weaver等發(fā)現(xiàn)在60℃以上牛乳中的溶菌酶活性下降。Hayase等發(fā)現(xiàn)溶菌酶通過(guò)二硫鍵聚合，180℃時(shí)聚合和降解同時(shí)進(jìn)行，當(dāng)>200℃時(shí)肽鍵的斷裂和重組發(fā)生，聚合和降解變得更為劇烈。Frasco等用紅外光譜研究了溶菌酶的熱變性機(jī)理，發(fā)現(xiàn)它是和水結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的。其它外側(cè)非極性氨基酸殘基對(duì)變性無(wú)重要影響，從外側(cè)極性氨基酸游離出的水在其始變性過(guò)程中起重要作用，水進(jìn)入內(nèi)部肽-肽鍵中，使蛋白質(zhì)膨脹和伸展。第70頁(yè)/共89頁(yè)5.2.2.2pH對(duì)溶菌酶活性的影響

溶菌酶在酸性pH下是穩(wěn)定的，此時(shí)100℃的加熱對(duì)溶菌酶僅有很小的活性損失。Matsuoka等報(bào)道pH4.5(100℃、3min)、pH5.29(100℃，30min)的加熱對(duì)溶菌酶是穩(wěn)定的。Beychok等報(bào)道溶菌酶在pH5.5最為穩(wěn)定。第71頁(yè)/共89頁(yè)5.2.2.3化學(xué)物質(zhì)對(duì)溶菌酶的影響B(tài)ack等研究表明糖和聚烯烴類(lèi)能增加溶菌酶的熱穩(wěn)定性，Hidaka等發(fā)現(xiàn)NaCl對(duì)溶菌酶也有抗熱變性作用。同時(shí)Kravchenko等發(fā)現(xiàn)鹽溶液的存在對(duì)溶菌酶的活性是十分必要的，Chang的研究也發(fā)現(xiàn)溶菌酶的活性在低鹽濃度時(shí)和離子強(qiáng)度密切相關(guān)的，在高鹽濃度時(shí)溶菌酶的活性受到抑制，陽(yáng)離子的價(jià)態(tài)越高則其抑制作用越強(qiáng)。Yashitake等發(fā)現(xiàn)具有-COOH和-SH3OH基的多糖對(duì)溶菌酶活性有抑制作用。第72頁(yè)/共89頁(yè)5.2.2.4加工過(guò)程對(duì)溶菌酶活性的影響在一個(gè)冷凍干燥的模擬體系中溶菌酶有聚合、生物活性損失和其它化學(xué)變化。溶菌酶和過(guò)氧亞油酸的反應(yīng)生成了二聚和高聚體；多聚是因?yàn)殡S水活性增加共價(jià)鍵交聯(lián)度、蛋白質(zhì)不溶性和酶活性損失增加引起的。第73頁(yè)/共89頁(yè)5.2.2.5絡(luò)合作用對(duì)溶菌酶活性的影響溶菌酶可和許多物質(zhì)形成絡(luò)合物導(dǎo)致其活性喪失。等量蛋清和蛋黃的混合物其溶菌酶無(wú)活性，脫水整蛋僅保留部分溶菌酶活性，蛋黃在pH6.2磷酸鹽緩沖液中使純?nèi)芫甘Щ?。研究者認(rèn)為抑制機(jī)理是在溶菌酶和蛋黃化合物間形成靜電相互作用的絡(luò)合物所致。第74頁(yè)/共89頁(yè)5.2.3溶菌酶的抗菌機(jī)理細(xì)菌的細(xì)胞壁由胞壁質(zhì)組成，胞壁質(zhì)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)及N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid)交替組成的多聚物，胞壁酸殘基上可以連接多肽，稱(chēng)為肽聚糖(Peptidoycan)。第75頁(yè)/共89頁(yè)肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4個(gè)氨基酸)組成，NAM與NAG通過(guò)β-l，4糖苷鍵相連，肽“尾”則是通過(guò)D-乳酰羧基連在NAM的第3位碳原子上，肽尾之間通過(guò)肽“橋”(肽鍵或少數(shù)幾個(gè)氨基酸)連接，NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，作為細(xì)胞壁的骨架，上述結(jié)構(gòu)中的任何化學(xué)鍵斷裂，皆能導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷。第76頁(yè)/共89頁(yè)溶菌酶能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，其水解位點(diǎn)是N-乙酰胞壁酸(NAM)的l位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子間的β-l，4糖苷鍵，結(jié)果使細(xì)菌細(xì)胞壁變得松弛，失去對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，最后細(xì)胞溶解死亡。對(duì)于G+細(xì)菌與G-細(xì)菌，其細(xì)胞壁中肽聚糖含量不同，G+細(xì)菌細(xì)胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而G-細(xì)菌只有內(nèi)壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶只能破壞G+細(xì)菌的細(xì)胞壁，而對(duì)G-細(xì)菌作用不大。第77頁(yè)/共89頁(yè)5.2.4溶菌酶在食品上的應(yīng)用第78頁(yè)/共89頁(yè)5.2.4.1溶菌酶用于水產(chǎn)類(lèi)熟制品、肉類(lèi)制品的防腐和保鮮溶菌酶可作為魚(yú)丸等水產(chǎn)類(lèi)熟制品和香腸、紅腸等肉類(lèi)熟制品的防腐劑。只要將一定濃度(通常為0.05%)的溶菌酶溶液噴灑在水產(chǎn)品或肉類(lèi)上，就可起到防腐保鮮的作用。第79頁(yè)/共89頁(yè)5.2.4.2用于新鮮海產(chǎn)品和水產(chǎn)品的保鮮一些新鮮海產(chǎn)品和水產(chǎn)品(如：蝦、蛤蜊肉等)在0.05%的溶酶菌和3%的食鹽溶