基因的體外轉錄和翻譯

基因的體外轉錄和翻譯第1頁/共46頁09三月20232基因表達包括：轉錄和翻譯兩個過程?；虮磉_的調控包括：染色體結構的調節(jié)、DNA結構的調節(jié)、轉錄過程的調控、轉錄后的調控、翻譯過程的調控及翻譯后的調控。第2頁/共46頁09三月20233基因體外轉錄和翻譯的作用：為研究基因轉錄和蛋白質翻譯提供了一個十分理想實驗體系和技術平臺及找到了一個研究與探討轉錄和翻譯這兩個復雜的現(xiàn)象的重要手段和方法。第3頁/共46頁09三月20234第一節(jié)基因的體外轉錄一、基因體外轉錄的目的和意義基因的體外轉錄體系最早由Pelham和Jakson于1976年創(chuàng)立的，經很多實驗室的不斷修訂和改進，現(xiàn)已成為一項成熟的分子生物學和細胞生物學技術，已被多家試劑公司提供標準的實驗程序。第4頁/共46頁09三月20235基因體外轉錄體系在分子生物學和細胞生物學研究中的用途和意義：1、快速檢測目的基因的轉錄情況；2、分析轉錄因子調節(jié)基因轉錄的過程；3、分析啟動子序列的活性；4、分析轉錄因子、DNA結合蛋白和RNA剪切因子的組成和作用；5、染色質結構調整與基因轉錄的關系；6、制備RNA探針。第5頁/共46頁09三月20236一、基因體外轉錄的基本原理基本原理：以DNA為模板，在無細胞體系中一系列轉錄因子的作用下經RNA聚合酶合成RNA的過程。模板質粒DNA線性DNA核小體形式存在的DNA第6頁/共46頁09三月20237能用于體外轉錄的質粒載體轉錄的必要條件：無論是真核細胞的轉錄體系還是原核細胞的轉錄體系，基因轉錄時都必須有啟動子序列，且該序列能被轉錄體系識別。原核細胞體外轉錄體系常用的啟動子有T3、T7及SP6啟動子。真核細胞體外轉錄體系除需啟動子，增強子等順式作用元件外，還需各種反式作用元件的參與。第7頁/共46頁09三月20238基因體外轉錄體系DNA模板：含有轉錄啟動子及必要的調控序列(起始和終止序列等)的DNA及為研究基因轉錄調控的需要,在體外組裝成的核小體鏈(注意避免RNase的污染)。第8頁/共46頁09三月20239細胞核抽提物：DNA轉錄由RNA聚合酶、各種轉錄因子及必要的環(huán)境條件等，這一切必需由細胞提供。常用于制備細胞核抽提物的細胞有酵母細胞、兔網織紅細胞和Hela細胞細胞核抽提物的制備：1、一般方法優(yōu)點：細胞核完整、內含物豐富缺點：在分離的細胞核中可能存在少量細胞質成分第9頁/共46頁09三月202310(1)收集細胞：取5×106/ml的培養(yǎng)細胞20ml，1500rpm離心5min，用新配制的0.01mol/LPBS洗滌，收集細胞。(2)低滲液裂解細胞并純化細胞核：將收集的細胞迅速加入原體積1/10的低滲緩沖液[0.01mmol/LHEPES(4－羥基乙基哌嗪乙磺酸)pH7.9,10mmol/LKCl，1.5mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)，0.2mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用玻璃勻漿器勻漿，3000rpm離心15min得細胞核沉淀。第10頁/共46頁09三月202311第11頁/共46頁09三月202312(3)裂解細胞核：向細胞核沉淀中加入2倍體積的低鹽緩沖液(20mmol/LHEPES，pH7.9，25％甘油，1.5mmol/LMgCl2，20mmol/LKCl，0.2mmol/LEDTA，0.2mmol/LPMSF，0.5mmol/LDTT)，冰浴10min，用玻璃勻漿器勻漿。滴加入2倍核沉淀體積的高鹽緩沖液冰浴輕輕攪拌30min。第12頁/共46頁09三月202313(4)收集核提取物：25000g離心30min，收集上清液后，用緩沖液透析2h后，4℃，25000g離心20min，上清液置-70℃保存。(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物總蛋白濃度采用Bradford法測定，以牛白蛋白為參照。第13頁/共46頁09三月202314附：Bradford法測蛋白含量1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

第14頁/共46頁09三月202315考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。

在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。

第15頁/共46頁09三月202316Bradford法的突出優(yōu)點是：

（1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。

第16頁/共46頁09三月202317（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

第17頁/共46頁09三月202318（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K、Na、Mg2

離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點是：

（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。

第18頁/共46頁09三月202319（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH

（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。

第19頁/共46頁09三月2023202、精胺－亞精胺混合物改進法優(yōu)點：分離到的細胞核比較純凈缺點：分離過程中一些特殊的試劑破壞了細胞核膜，造成核內容物的部分流失及操作過程中精胺易使DNA模板產生沉淀第20頁/共46頁09三月202321過程：收集細胞：收集一定數(shù)量的培養(yǎng)細胞，300g離心5min，沉淀用分離液清洗2次。裂解細胞純化細胞核：沉淀中加入預冷的勻漿液1/10(原體積)，冰浴10min后，勻漿，鏡檢，至90%細胞破碎，細胞核游離出來為止，550g離心8min。第21頁/共46頁09三月202322收集細胞核：沉淀用細胞分離液洗1次，550g離心8min，收集細胞核沉淀。裂解細胞核：取沉淀重懸于原體積1/100的細胞核裂解液中，攪拌30min，100000g離心30min。第22頁/共46頁09三月202323核提取物的濃縮：測上清體積，按1ml上清液加入0.33g硫酸銨粉末。5~10min內緩慢加入并攪拌30min。100000g離心15min沉淀蛋白。沉淀物溶于1/200原體積的透析緩沖液，4℃透析4~5h。第23頁/共46頁09三月202324核提取物的保存：高速離心10min。去除不溶物，測定蛋白濃度，用預冷的小管分裝。提取物可在液氮中凍存，－80℃可保存數(shù)月。如有沉淀，可高速離心10min，去除不溶物。3、分離得到的細胞核比較純且沒有核蛋白的流失。2、得到的蛋白質具有轉錄活性。1、含有細胞核中的所有可溶性蛋白。制備細胞核提取物時應注意：第24頁/共46頁09三月202325體外基因轉錄反應體外基因轉錄一般用硅化的1.5ml塑料管，在24~32℃條件下進行，為了保證產物的穩(wěn)定，反應體系中必須加入RNase抑制劑，終止反應時，可加入蛋白酶以降解核提取物中的RNase。同時加入酵母tRNA作為產物RNA的載體起到保護作用。反應體系中以四種核苷酸為底物，其中一種是被標記的。第25頁/共46頁09三月202326用提純的RNA聚合酶進行體外轉錄用細胞核提取物進行體外轉錄用RNA聚合酶III進行體外轉錄體外轉錄所用的酶及體系第26頁/共46頁09三月202327體外基因轉錄產物的分析：基因體外轉錄時，在反應體系中加入放射性標記的底物。反應后快速提取產物RNA，乙醇沉淀、凝膠電泳后放射自顯影分析產物?；蛏锼貥擞浫缓笥糜H和素－辣根過氧化物酶顯色系統(tǒng)檢測。第27頁/共46頁09三月202328體外轉錄方法的選擇體外轉錄的方法有用不同RNA聚合酶的基因轉錄體系原核轉錄體系真核轉錄體系使用不同DNA模板的轉錄體系細胞核抽提物的轉錄體系第28頁/共46頁09三月202329第二節(jié)基因的體外翻譯基因體外翻譯的目的和意義基因的體外翻譯是將基因轉錄產物RNA在離體條件下直接合成蛋白質的過程。第29頁/共46頁09三月202330體外翻譯的實驗方法主要用于：1、基因產物的快速確定；2、基因突變體的快速和分析；3、蛋白質活性研究；4、眾多基因產物的同時表達；5、大分子間的相互作用；6、影響翻譯過程的物質檢出；7、表達對細胞有毒性的蛋白和易于被細胞內蛋白酶降解的蛋白和形成不溶包含物的蛋白。第30頁/共46頁09三月202331基因體外翻譯的基本原理基因體外翻譯的基本原理是以基因轉錄產物RNA為模板，在核糖體上進一步生產蛋白質的過程?；蝮w外翻譯的模板：1、直接來自體外基因轉錄實驗；2、細胞內提取的mRNA；3、通過PCR或RT-PCR產物轉錄后的RNA。第31頁/共46頁09三月202332利用不同模板和翻譯體系進行翻譯時，應匹配相應的翻譯起始序列。如用原核細胞翻譯體系時RNA模板應含有SD序列，應用真核翻譯體系時，應有帽子結構；在RNA的3ˊ未端含有合適的終止信號。第32頁/共46頁09三月202333基因體外翻譯的基本實驗流程體外翻譯系統(tǒng)的制備：該系統(tǒng)為基因體外翻譯提供必要的條件。1、核糖體：是蛋白質合成的裝配機；2、環(huán)境條件：如離子、翻譯過程中所需的各種因子等。第33頁/共46頁09三月202334常用的翻譯系統(tǒng)的制備：1、細胞裂解物的制備(1)收集一定數(shù)量生長良好的細胞，于10ml培養(yǎng)液中，1500rpm離心5min。得細胞沉淀，用0.01mol/LPBS漂洗2次；第34頁/共46頁09三月202335(2)用10倍細胞體積的預冷緩沖液裂解細胞(1%TritonX100，150mmol/LNaCl，10mmol/LTris.HClpH7.4，1mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，pH8.00.2mmol/LPMSF，0.5％NP-40)（EGTA：乙二醇二乙醚四乙酸；PMSF：苯甲基磺酰氟；NP-40：壬基酚聚氧乙烯－40醚）；第35頁/共46頁09三月202336(3)裂解液4℃下攪動5min，16000g離心15min后，上清液即為細胞裂解物。細胞的主要來源：酵母細胞、麥芽組織細胞、兔網織紅細胞和Hela細胞。第36頁/共46頁09三月2023372、細胞核糖體的分離：(1)收集一定數(shù)量的成纖維細胞，迅速放于冰上，4℃600g離心10min，收集細胞沉淀，用預冷的TBS懸浮細胞并洗滌3次。(2)用2倍體積的TBS-M(10mool/LTris.Cl,pH7.5,10mmol/LKCl和1.5mmol/L乙酸鎂)懸浮最后的細胞沉淀，0℃放置5min，在勻漿器中勻漿10~20次。第37頁/共46頁09三月202338(3)每0.9ml勻漿液加0.1ml濃縮的10*TBS-M緩沖液，混合，4℃10000g離心10min。(4)收集上清提取物，在提取物中加入ATP，GTP磷酸肌酸，肌酸激酶及各種氨基酸。(5)37℃培養(yǎng)45min。(6)室溫下10000g離心混合物10min，冷卻上清，在4℃

條件下進行SephadexG-25柱層析。收集260nm吸收峰，4℃165000g離心90min

。第38頁/共46頁09三月202339(7)加入飽和的(NH4)2SO4的終濃度為60%，經離心收集沉淀。在含有0.25mol/L蔗糖的TBS緩沖液，懸浮有核糖體的液體放在上層，4℃216000g離心2.5h。用TBS-M緩沖液洗滌沉淀，懸浮在具有0.25mol/L蔗糖的同一緩沖液中。(8)用UV光譜儀測A260，確定核糖體濃度。第39頁/共46頁09三月202340基因的體外翻譯反應基因體外翻譯一般在25~35℃溫度條件下進行，反應體積在40~100ul之間，反應體系中主要有：5或10倍的翻譯緩沖液10~30ul轉錄產物，20~50ul細胞裂解物或1~3