細(xì)胞生物學(xué)之細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的分子機(jī)制

細(xì)胞生物學(xué)之細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的分子機(jī)制第一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)

1951年，發(fā)育生物學(xué)家Glucksman在研究蛾的發(fā)育時(shí)提出PCD一詞；1972年，Kerr等對(duì)肝細(xì)胞溶酶體的組化研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎大鼠門脈左側(cè)支數(shù)小時(shí)后引起肝左葉細(xì)胞片狀死亡，但不同于細(xì)胞壞死，因而將細(xì)胞的這種死亡命為細(xì)胞凋亡。大多數(shù)情況下程序化細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡.第二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)凋亡細(xì)胞的特征及生物學(xué)意義(一)細(xì)胞凋亡的組織學(xué)變化

只發(fā)生在單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞，其緊鄰細(xì)胞完好；與緊鄰細(xì)胞間有空隙，有離群、脫落感；不引起炎癥反應(yīng)(二)主要形態(tài)學(xué)特征(多階段)凋亡細(xì)胞其形態(tài)特征表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變??；核固縮，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞急劇變??；細(xì)胞骨架解體，最后變成若干個(gè)凋亡小體。

注意點(diǎn)：凋亡全過(guò)程，質(zhì)膜仍保持完整，細(xì)胞內(nèi)容物不釋放，不引起炎癥反應(yīng)。一、細(xì)胞凋亡的基本特征第三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日1.細(xì)胞核的變化

核內(nèi)染色質(zhì)凝聚、形成染色質(zhì)塊，并聚集于核的邊緣呈多種形狀排列，然后逐步分裂為碎片（核碎片形成）。2.細(xì)胞質(zhì)的變化(1)胞質(zhì)脫水濃縮，體積減少約30%(2)

細(xì)胞器的變化:A.線粒體早期體積增大，嵴增多晚期成空泡狀,B失去微絨毛、細(xì)胞突起及細(xì)胞表面皺褶，膜電位下降，膜流動(dòng)性下降；C.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大；D.細(xì)胞骨架變得致密和紊亂。第四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日3.凋亡小體的形成*凋亡小體的概念指凋亡的最后階段，由胞質(zhì)分割形成大小不等，含有細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞器及核碎片的膜包被小體。*形成機(jī)制（1）細(xì)胞表面突起形成-------包裹膜融合、根部縮窄→脫落（2）胞內(nèi)自噬體形成-------向胞外釋放應(yīng)指出！有時(shí)凋亡細(xì)胞膜不分割，僅發(fā)生核固縮和胞質(zhì)高度濃縮成單個(gè)致密結(jié)構(gòu)亦稱凋亡小體。第五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日凋亡時(shí)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變空泡化固縮出芽邊集凋亡小體第六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日(二)細(xì)胞凋亡的生化特征1.DNA片段化（主）凋亡細(xì)胞DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈特征性梯狀條帶圖譜（Ladder）。機(jī)制：核小體中的組蛋白與DNA的連結(jié)鍵斷裂，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，有控制的特異地將DNA降解為180~200bp整數(shù)倍大小的若干條帶。第七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日DNAFragmentation

NucleosomalBandingPattern第八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日3.其它生化改變1)胞漿Ca2+水平

與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切，實(shí)驗(yàn)證明，凋亡的發(fā)生伴隨胞漿Ca的升高。2)胞漿H離子濃度

細(xì)胞凋亡伴隨胞漿PH下降。3)線粒體

凋亡時(shí)，呼吸鏈?zhǔn)軗p，ATP合成下降，膜電位下降(Δψm)；膜通透性增加。4)細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻膜磷脂的不對(duì)稱性分布改變,凋亡時(shí)PS由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè).第九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（二）細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別-1細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素細(xì)胞數(shù)量膜完整性染色質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞器胞內(nèi)容物生理性、弱刺激性單個(gè)細(xì)胞丟失保持至晚凝聚呈半月狀早期固縮、斷裂無(wú)明顯變化無(wú)釋放強(qiáng)烈刺激成群細(xì)胞死亡早期即喪失稀疏呈網(wǎng)狀晚期破碎腫脹、破壞釋放第十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死細(xì)胞形狀基因組DNA大分子合成基因調(diào)控后果意義形成凋亡小體受調(diào)控降解一般需要有不引起炎癥反應(yīng)生理性死亡破裂成碎片隨機(jī)降解不需要無(wú)引起炎癥反應(yīng)病理性死亡

細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別-2第十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日二、細(xì)胞凋亡的廣泛性及其意義

作為一種生理性細(xì)胞消亡方式，普遍存在生物界；例如：1高等脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中某些細(xì)胞的丟失;2兩棲類動(dòng)物變態(tài)過(guò)程中幼體器官的退化;3成熟個(gè)體中亦有細(xì)胞凋亡發(fā)生，如：血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等以正常細(xì)胞更新衰老細(xì)胞過(guò)程；4通過(guò)凋亡清除受損傷或癌前病變的細(xì)胞,防止癌變;5病毒、藥物、毒物等均能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。第十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義其一:

具有清除個(gè)體發(fā)育過(guò)程及成熟個(gè)體中多余細(xì)胞及老化細(xì)胞的機(jī)體調(diào)節(jié)作用其二:

具有消除對(duì)機(jī)體有害的癌變細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞的機(jī)體防御作用因此，細(xì)胞凋亡是維持個(gè)體生存所必需的一種生物學(xué)機(jī)制第十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制一、細(xì)胞凋亡的酶學(xué)基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白酶和核酸酶的活化是凋亡過(guò)程的核心事件。有人甚至認(rèn)為細(xì)胞凋亡過(guò)程就是蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程。第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（一）caspase家族與細(xì)胞凋亡Caspase即天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(Cysteinylaspartate-specificprotease);是一類與白介素-1?

轉(zhuǎn)化酶和線蟲凋亡基因Ced(ICE/Ced)同源的一類半胱氨酸蛋白酶;活性位點(diǎn)含有保守的aa序列(QACXG,X為R,Q或G);以無(wú)活性的酶原形式合成并存在于細(xì)胞中；可以被上游Caspase或自身切割保守的ASP活化；1.Caspase的性質(zhì)和種類第十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日已在哺乳類中發(fā)現(xiàn)14種，分為3個(gè)亞類：Caspase-1亞家族，Caspase-2亞家族，Caspase-3亞家族亦可根據(jù)前體分子(procaspase)N端的原結(jié)構(gòu)域(prodomain)分為2類:具”Long-prodomain”的啟始分子(initiator),如-8、-9、-10等，為蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；具”short-prodomain”的效應(yīng)分子(effector),如-3、-6、-7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細(xì)胞凋亡。第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日2.Caspase的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和活化機(jī)制原結(jié)構(gòu)域大亞基小亞基N端D28QACRGD175IETDCaspase異二聚體化異四聚體化蛋白酶活性第十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日3.Caspase活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程多種凋亡因素，通過(guò)多種途徑活化Caspase;

凋亡時(shí)起始Caspase首先被活化,其后又切割并活化下游Caspase,級(jí)聯(lián)放大,直至效應(yīng)Caspase被活化；細(xì)胞中的Caspase一旦被活化,凋亡即不可避免;第十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.效應(yīng)caspase引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制

已發(fā)現(xiàn)的caspase底物上百種,僅少數(shù)底物與凋亡的關(guān)系被確認(rèn);滅活細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白非凋亡細(xì)胞中,CDA(caspase活化的DNAase)與其抑制蛋白(ICDA)結(jié)合;凋亡細(xì)胞中,caspase剪切ICDA;CDA游離并進(jìn)入核內(nèi)降解DNA,細(xì)胞凋亡.剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白如Caspase對(duì)核板的降解作用;

在凋亡過(guò)程中,caspase在單一位點(diǎn)剪切核纖層蛋白(lamin),導(dǎo)致核板塌陷,染色質(zhì)濃縮.剪切效應(yīng)蛋白:如參與基因表達(dá)蛋白因子,如PARP活化caspase抑制劑第十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日(二)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的其他酶類核酸內(nèi)切酶(endonuclease)主要是DNase,包括DNaseⅠ、DNaseⅡ、NUC18等；大多數(shù)DNase在細(xì)胞凋亡時(shí)作為caspase的底物被活化并發(fā)揮作用，如CAD等；其作用點(diǎn)是核小體的連接處切割DNA，產(chǎn)生180~200bp的Ladder.蛋白激酶(proteinkinase，PK)PKC可通過(guò)caspase相互作用影響細(xì)胞凋亡；DNA-PK（DNA依賴性蛋白激酶），活化后參與DNA損傷與修復(fù)，能抑制凋亡，能被caspase-3滅活。其他酶類：絲氨酸蛋白酶（如粒酶B）、calpain、NOS等第二十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日二、細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞途徑細(xì)胞凋亡的影響信號(hào)分為2類：一類為凋亡的負(fù)調(diào)控信號(hào)（抑制凋亡）；另類為凋亡的正調(diào)控信號(hào)（誘導(dǎo)凋亡）細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特點(diǎn)：同一性：各種因素引起的凋亡的形態(tài)與生化改變均相同。

多樣性：環(huán)境因素不同，細(xì)胞類型不同，或刺激因素不同時(shí)，從凋亡程序啟動(dòng)到凋亡發(fā)生，其信號(hào)傳遞途徑是不同的。

分類：百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成一條條的信息傳導(dǎo)通路，可分為基本傳導(dǎo)通路和非專一性傳導(dǎo)通路二類。第二十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（一）死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡死亡受體(deathreceptors,DR)：指細(xì)胞表面存在的一類能結(jié)合凋亡剌激分子，并將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)引起細(xì)胞凋亡的受體。屬腫瘤壞死因子受體（TNF）超家族；包括1~6個(gè)富Cys結(jié)構(gòu)域組成的保守的胞外區(qū)，和一個(gè)由60~80aa組成的“死亡結(jié)構(gòu)域”

(deathdomain,DD)；DD將受體信號(hào)與胞內(nèi)凋亡機(jī)制相偶聯(lián)；分類：CD95(Fas/Apol),TNFR1,TNFR2,DR3(Apol3/Esl1)等近十種。第二十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日“死亡結(jié)構(gòu)域”概念：是凋亡信號(hào)受體共有的、存在于胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。種類：FADD：fas-associateddeathdomain(Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域)；TRADD：TNFrecptor-associateddeathdomain(TNF1受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域)；RIP：receptorinteractingprotein(受體相互作用蛋白)（含相似的死亡域）DD的活化或過(guò)表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.第二十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日TNFTNFTNFDDDDDDTNFR1DDDD死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)形成DDRIPDDFADDDED活化NF-?B，AP-1促進(jìn)炎癥，免疫反應(yīng)等活化Caspase-8Caspase級(jí)聯(lián)放大細(xì)胞凋亡TRADD第二十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（二）線粒體相關(guān)蛋白的凋亡誘導(dǎo)途徑線粒體細(xì)胞凋亡過(guò)程中既是引發(fā)器，又是信號(hào)放大器；幾乎所有的誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡都伴隨著線粒體跨膜電位(Δψm)的下降;Δψm的維持，與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）部分相關(guān)；幾乎所有的凋亡誘導(dǎo)因素導(dǎo)致MPT破壞或開放；開放的后果是，Δψm

下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生等，并形成惡習(xí)性循環(huán)。MPT的這種自我放大效應(yīng)，很可能是一種細(xì)胞死亡“全或無(wú)”的開關(guān)。第二十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)分子在多種誘導(dǎo)因子（如Bax過(guò)表達(dá)、UV照射）作用下，MPT開放和外膜破壞；線粒體釋放多種凋亡相關(guān)分子，如CytC、Smac、EndoG等細(xì)胞色素C：釋放到胞質(zhì)中的CytC，可特異性地結(jié)合接頭蛋白Apaf并使之寡聚化，Apaf借助N-端caspase相關(guān)征驀結(jié)構(gòu)域（CARD）,直接驀集多個(gè)caspase-9并使之活--------凋亡。第二十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑（略）細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制之一，就是通過(guò)粒酶B來(lái)實(shí)現(xiàn)的。粒酶B的特點(diǎn)粒酶（cranzyme,Cr）是CTL和NK細(xì)胞殺傷性顆粒中絲氨酸蛋白酶家族的總稱；首先酶原形式合成，受刺激后激活；已發(fā)現(xiàn)5種：CrA、B，H、M和類胰蛋白酶-2;其中以CrB促凋亡作用最強(qiáng);（三）粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡第二十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日粒酶B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑CrB由CTL分泌進(jìn)入靶細(xì)胞胞漿后,其絲氨酸蛋白酶在胞漿pH7.0條件下發(fā)揮最佳活性，切割胞漿和核中的多種底物；以此介導(dǎo)的死亡途徑是多層次、多水平的，以便快速清除異常細(xì)胞；Caspase依賴的死亡通路是CrB介導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要途徑之一：在體外，pro-Caspase家族中，除-1外其余的都可被CrB切割活化，-10和-7是CrB的最適底物；線粒體介導(dǎo)的死亡途徑是另一個(gè)重要的途徑：需要多種蛋白質(zhì)（如Bax、Bid、Bak）參與，與線粒體膜通透性及Δψm

有關(guān)。第二十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日死亡受體(Fas/CD95,TNFR1)CD95配體,TNF-αFADDCaspase-8,10Caspase-3,6,7PARP,Lamin,PK,DNA-PKDNA斷裂,細(xì)胞固縮等細(xì)胞凋亡Caspase激活物起始Caspase效應(yīng)CaspaseCaspase底物CTL粒酶B,穿孔素胞外CrB生長(zhǎng)因子撤除,化學(xué)藥物等CytCApaf-1Caspase-9AIF,endoG凋亡主要途徑小結(jié)第二十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)細(xì)胞凋亡的調(diào)控

目前普遍認(rèn)為，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞分裂、分化類似，受細(xì)胞內(nèi)多種基因的調(diào)控，是一個(gè)級(jí)聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果。

已發(fā)現(xiàn)許多基因參與細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控，包括：ced、bcl-2、ICE、

p53、IAP家族、Fas/Apo、c-myc等。

至今調(diào)控機(jī)理尚未十分明了。第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日P53的結(jié)構(gòu)：p53基因位于人染色體的17p13.17，編碼53kDa的P53蛋白轉(zhuǎn)錄因子；野生型P53蛋白由393aa組成，活性形式為四聚體；自N端起包括：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、四聚體化區(qū)和C-調(diào)節(jié)區(qū)；C-端的26aa構(gòu)成一個(gè)開放的結(jié)構(gòu)域，易被降解或磷酸化修飾，受其他蛋白調(diào)節(jié)。一、細(xì)胞自身蛋白的調(diào)控作用（一）P53蛋白的調(diào)控作用第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日P53的表達(dá)與活性調(diào)節(jié)正常狀態(tài)下：胞漿P53水平很低，半衰期很短，胞內(nèi)P53被嚴(yán)格監(jiān)控，受HDM2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，并通過(guò)泛素降解途徑調(diào)節(jié)P53水平。異常情況下：當(dāng)細(xì)胞DNA損傷、紡錘體絲斷裂、癌基因異常表達(dá)等細(xì)胞生存面臨威脅時(shí)；P53水平迅速升高和活化；第三十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日P53對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用野生型P53蛋白：具維持細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制惡性增殖的作用；P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；如果損傷不能修復(fù)，P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。突變型P53蛋白：?jiǎn)适б种萍?xì)胞惡性增殖功能，p53基因突變是50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。第三十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日P53蛋白——基因衛(wèi)士P53蛋白解鏈酶復(fù)制因子AP21蛋白細(xì)胞停滯于G1期細(xì)胞凋亡酸性區(qū)核心區(qū)堿性區(qū)P53蛋白DNA損傷P21基因P53蛋白抑制P53蛋白成功修復(fù)修復(fù)失敗細(xì)胞周期第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日(二)Bcl-2基因家族bcl-2基因bcl-2基因發(fā)現(xiàn)于1985年。定位于18q21基因長(zhǎng)約230kb（2個(gè)內(nèi)含子各3個(gè)外顯子），編碼23kd膜鑲嵌蛋白質(zhì)，與Ced-9有23%的同源性。

Bcl-2對(duì)需要長(zhǎng)期生存的細(xì)胞,如神經(jīng)細(xì)胞、免疫記憶細(xì)胞和造血祖細(xì)胞等的壽命有重要意義。急性淋巴細(xì)胞白血病，急性髓細(xì)胞白血病，慢性粒細(xì)胞白血病，細(xì)胞膜內(nèi)Bcl-2蛋白質(zhì)增加顯著。第三十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日Bcl-2的功能屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，但對(duì)細(xì)胞周期和分化無(wú)影響阻止或減少各種刺激引起的細(xì)胞損傷。如Bcl-2能阻止由r射線和多種化療藥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白具抗氧化作用Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞器內(nèi)Ca2+

離子向胞質(zhì)釋放，而凋亡必須有Ca2+

離子參與。第三十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日bcl-2家族

家族成員可能存在的聚合體形式抑制凋亡促進(jìn)凋亡bcl-2

Bcl-2/Bcl-2Bax/Bcl-2bcl-xLBcl-xL/bcl-xLBcl-2/Bcl-xL

baxBax/BaxBax/Bcl-2badBad/Bcl-2Bad/Bcl-xLbcl-xsBcl-xs/Bcl-2Bcl-xs/Bcl-xLMcl-1Mcl-1/bcl-xLMcl-1/Bcl-2第三十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日Bcl-2家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制Bcl-2、Bax和Bcl-x組成一個(gè)凋亡調(diào)控系統(tǒng)當(dāng)Bax/Bax同源二聚體形成時(shí)，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；隨bcl-2表達(dá)量增加，漸多的Bax/Bax解聚，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl-2異源二聚體，從而中和了‘Bax/Bax’誘導(dǎo)凋亡的作用。即Bax和Bcl-2比值調(diào)節(jié)凋亡；當(dāng)Bcl-xs存在時(shí)，優(yōu)先形成Bcl-xs/Bcl-2

，使Bax/Bax形式保留，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第三十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用技術(shù)

一、凋亡的形態(tài)學(xué)檢查（光鏡、電鏡）1蘇木素—伊紅（HE）染色法:應(yīng)用范圍：石蠟組織切片、細(xì)胞涂片結(jié)果判斷：正常細(xì)胞保持原生長(zhǎng)形狀，梭形或多角形；細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡黃色。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核染色致密濃縮、核碎裂；凋亡細(xì)胞涂片可見凋亡小體。壞死細(xì)胞呈均質(zhì)紅染，無(wú)結(jié)構(gòu)、核染色消失。第三十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日2.甲基綠—派諾寧染色法:3.Giemsa染色法:4.瑞氏(Wright)染色法5.透射電子顯微鏡觀察法第四十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日二、熒光顯微鏡觀察法吖啶橙染色法、Hoechst染色法Hoechst染色法第四十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（一）瓊脂糖凝膠電泳法

基本操作步驟：染色體組DNA提取1~1.5%瓊脂糖電泳(含EB)電泳后于紫外燈下觀察并照相留底有無(wú)200bp左右的ladder出現(xiàn)作為判斷細(xì)胞凋亡亦可進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳.三、凋亡細(xì)胞的生化特征的檢測(cè)第四十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日(二)原位末端標(biāo)記技術(shù)

(insituend–lableing,ISEL)原理:ISEL的原理是基于細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）或DNA聚合酶將帶有生物素標(biāo)記的核苷酸（biotin-16-dUTP）摻入到斷裂的DNA的3’端，再使其與帶有辣根過(guò)氧化物酶的抗生物蛋白結(jié)合，經(jīng)DAB顯色后，便可觀察到細(xì)胞內(nèi)是否存在DNA片段端存在。主要方法有2種:1.TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)2.DNA聚合酶I或klenow大片段介導(dǎo)的原位的缺口平移(ISNT)該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細(xì)胞.第四十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日四、凋亡細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基本操作步驟:

離心收集細(xì)胞---重懸于70%乙醇,-20℃固定24小時(shí)---離心后重懸細(xì)胞PBS緩沖液---加PI（碘化丙啶）染色(含RNaseA),37℃保溫30min---流式細(xì)胞術(shù)分析

亦可用PI/Hoechst雙染.

通過(guò)亞二倍體峰的的有無(wú)及面積積分來(lái)評(píng)斷細(xì)胞凋亡.第四十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日第六節(jié)細(xì)胞凋亡與臨床疾病

機(jī)體的生存取決于機(jī)體是否于平衡狀態(tài)，而最重要的平衡是細(xì)胞數(shù)量的平衡，這種平衡又取決于細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡（及壞死）。

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物體內(nèi)一個(gè)重要的生命現(xiàn)象，既可發(fā)生在個(gè)體發(fā)育過(guò)程和成體正常生理過(guò)程；亦可發(fā)生疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

細(xì)胞凋亡的失調(diào)與許