第二章目的基因獲得演示文稿

第二章目的基因獲得演示文稿當(dāng)前1頁，總共102頁。（優(yōu)選）第二章目的基因獲得當(dāng)前2頁，總共102頁。三、目的基因的獲得限制酶酶切直接分離法PCR擴(kuò)增法從mRNA合成cDNA化學(xué)合成法通過構(gòu)建基因文庫分離法當(dāng)前3頁，總共102頁。對已克隆在載體中的目的基因，可根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制酶識別序列，選擇適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?，獲得目的基因。（一）限制酶酶切直接分離法注意：目的基因內(nèi)部不能有該限制酶的切點(diǎn)，否則目的基因會被切成碎片！當(dāng)前4頁，總共102頁。Ampr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoRINotIBglIIhVEGF165BglII9.8KbTTSAmpr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1

pPIC9K9.3KbBglIIBglIISnaBIEcoRIAvrIINotISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5Kb當(dāng)前5頁，總共102頁。

（二）PCR法擴(kuò)增目的基因利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-退火-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的操作技術(shù)。PCR(polymerasechainreaction)：當(dāng)前6頁，總共102頁。以目的基因為模板，合成互補(bǔ)的新DNA鏈。雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA；引物與模板單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位配對、結(jié)合；退火：變性：延伸：變性退火延伸當(dāng)前7頁，總共102頁。

30thcycle？由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，即Y=2n(n為循環(huán)次數(shù))。230(109)copies當(dāng)前8頁，總共102頁。PCR技術(shù)的發(fā)明--DNA操作技術(shù)的革命發(fā)明人：美國生化學(xué)家KaryB.MullisTheNobelPrizeinChemistry1993MullisKB.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican.1990,262(4):56-61,64-5.1990.04MullisKB.Dancingnakedinthemindfields.1998.04當(dāng)前9頁，總共102頁。1983.03

開汽車時的聯(lián)想：蜿蜒崎嶇的山路--DNA雙螺旋行駛的汽車--一小段DNA引物1972在加州大學(xué)伯克利分校獲得博士學(xué)位1979進(jìn)入私人生物技術(shù)公司Cetus

1983.08正式做有關(guān)PCR原理的報告1983.09Mullis開始動手做實(shí)驗1984.11首次取得可信結(jié)果1985.01

RandallSaiki加入，結(jié)果毋庸置疑當(dāng)前10頁，總共102頁。1985.03Cetus公司申請專利1985.12SaikiRK,ScharfSJ,FaloonaFA,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05冷泉港“人類分子生物學(xué)”專題研討會1987.01MullisKB,FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology.1987,155:335-50.當(dāng)前11頁，總共102頁。1991.12Cetus以$3億將專利賣給Hoffmann-LaRoche公司1986.06Saiki等將耐熱DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技術(shù)。SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989Science雜志將PCR列為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年。1986.09Mullis離開Cetus公司當(dāng)前12頁，總共102頁。EppendorfBio-radABI當(dāng)前13頁，總共102頁。PCR法擴(kuò)增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其兩側(cè)序列，化學(xué)合成與模板互補(bǔ)的上、下游引物。

當(dāng)前14頁，總共102頁。

Taq酶無3’→5’外切酶活性，無閱讀校正功能，在擴(kuò)增過程中會引起錯配，30次循環(huán)Taq酶錯配率約0.25％。措施：問題：

可能造成目的基因堿基序列的改變。原因：選擇高保真Taq酶，如Pfu。當(dāng)前15頁，總共102頁。因Taq酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。5’AAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物5’

由Taq酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，3’末端總是帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而這個堿基幾乎總是A，T載體TT5’5’T7lacZMCSoriAmpr可用T載體克隆。

當(dāng)前16頁，總共102頁。

（三）從mRNA合成cDNA以目的基因的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈，然后在Klenow酶作用下合成雙鏈cDNA。當(dāng)前17頁，總共102頁。此法適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆，如血紅蛋白珠蛋白基因。哺乳動物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中珠蛋白mRNA的比例占總mRNA的90%以上。當(dāng)前18頁，總共102頁。目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下。目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的50-90%。高豐度mRNA：低豐度mRNA：當(dāng)前19頁，總共102頁。步驟：dNTP逆轉(zhuǎn)錄酶primer逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈mRNAcDNA釣取目的基因的mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶去除mRNA-cDNA雜交鏈中的mRNA鏈cDNAKlenow酶dNTPKlenow酶合成cDNA第二鏈cDNAcDNA當(dāng)前20頁，總共102頁。釣取目的基因的mRNA：與oligo(dT)堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，非mRNA(tRNA、rRNA）流走。總mRNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纖維素柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纖維素柱總RNA1）提取特定組織或細(xì)胞的總RNA，用oligo(dT)纖維素柱分離總mRNA。當(dāng)前21頁，總共102頁。2）根據(jù)已知基因序列合成DNA探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來分離純化特定mRNA。與探針堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特定mRNA探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA纖維素柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA纖維素柱總mRNA當(dāng)前22頁，總共102頁?？寺∑蕉穗p鏈cDNA的方法：平端直接與載體連接；平端接同聚尾；加裝人工接頭(adapter)；加裝銜接物(linker)。當(dāng)前23頁，總共102頁。加裝同聚物尾：

利用TdT，在雙鏈cDNA和載體3’端加互補(bǔ)的同聚物尾，退火連接成重組分子。1972年，斯坦福大學(xué)P.Labban和P.Kaiser發(fā)明。CCCCCCCCCCCCdCTPTdTcDNA5’3’載體5’3’GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4DNAligase當(dāng)前24頁，總共102頁。加裝人工接頭(adapter)1978年，康奈爾大學(xué)吳瑞發(fā)明。

adapter是人工合成的一頭具有某種限制酶的粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。GTCGCAGCTTAA5’3’EcoRIadapter當(dāng)前25頁，總共102頁。注意：adapter易通過粘端堿基配對形成二聚體。GTCG

CAGCTTAA5’3’AATTCGAC

GCTG3’5’AATTCGAC

GCTGGTCGCAGCTTAA5’3’3’5’T4DNAligase將adapter連接到雙鏈cDNA的兩端，直接成為人工粘端。當(dāng)前26頁，總共102頁。CIP去除adapter的5’-P，使5’-P成為5’-OH。5’

P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P5’3’3’CIP5’OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH5’3’3’措施：當(dāng)前27頁，總共102頁。加裝銜接物(linker):

linker是人工合成的一段由10-12個核苷酸組成、具有一個或多個限制酶識別序列的平末端雙鏈寡核苷酸短片段。EcoRIlinker5’TGGAATTCCAACCTTAAGGT5’3’3’當(dāng)前28頁，總共102頁。將雙鏈cDNA與linker連接，再用限制酶酶切，可產(chǎn)生粘性末端。當(dāng)前29頁，總共102頁。

（四）化學(xué)合成法1979年，成功合成E.coli酪氨酸t(yī)RNA基因。

Science1976年，H.G.Khorana提出用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想；當(dāng)前30頁，總共102頁。已知目的基因的DNA序列?；瘜W(xué)合成法的前提：當(dāng)前31頁，總共102頁。小片段粘接法補(bǔ)釘延長法大片段酶促法

戰(zhàn)略：化學(xué)合成的DNA片斷一般局限在200bp以內(nèi)。當(dāng)前32頁，總共102頁。1）小片段粘接法：分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段?；旌贤嘶餞4DNAligase片斷之間有互補(bǔ)區(qū)，混合退火形成有斷點(diǎn)的雙鏈，再由T4DNAligase連接成完整雙鏈。當(dāng)前33頁，總共102頁。2）補(bǔ)釘延長法：混合退火片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可相互作為另一個片斷延長的引物，用Klenow酶延伸成完整雙鏈。T4DNA

ligaseKlenow分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段及20-30bp的單鏈DNA中片段。當(dāng)前34頁，總共102頁。3）大片段酶促法：分別合成40-50bp的單鏈DNA大片段?；旌贤嘶餞4DNA

ligaseKlenow片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可相互作為另一個片斷延長的引物，用Klenow酶延伸成完整雙鏈。當(dāng)前35頁，總共102頁?；瘜W(xué)合成的份額較大，成本較高。大片段化學(xué)合成的收率極低，如合成50bp的DNA單鏈大片段的總收率僅7.7%。三種方法各有利弊：小片段粘接法：大片段酶促法：化學(xué)合成DNA的單鏈片段愈短，收率愈高；化學(xué)合成的份額較小，成本較低；當(dāng)前36頁，總共102頁?；瘜W(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。當(dāng)前37頁，總共102頁。DNA合成儀是根據(jù)固相亞磷酰胺三酯法原理設(shè)計的。從反應(yīng)機(jī)理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酰胺三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。當(dāng)前38頁，總共102頁。DNA合成儀基因合成一般都是自己設(shè)計序列，交給商業(yè)公司合成。當(dāng)前39頁，總共102頁。DNA化學(xué)合成的用途：合成天然基因修飾改造基因設(shè)計新型基因合成測序或PCR引物制備寡核苷酸探針制備人工接頭(adaptor)和銜接物(linker)當(dāng)前40頁，總共102頁。合成天然基因：有些組織特異性mRNA含量很低，很難用cDNA法克隆。有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低。

如：生長激素釋放抑制激素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等。當(dāng)前41頁，總共102頁。合成寡核苷酸探針(oligonucleotideprobe)：根據(jù)已知核酸序列，用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段，作為探針使用。若未知核酸序列，可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列倒推出核酸序列，但需考慮密碼子的簡并性。當(dāng)前42頁，總共102頁。大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子。某段連續(xù)的氨基酸序列:CysMetAspGluMetLys可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAA

CTG

G

設(shè)計系列探針:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG當(dāng)前43頁，總共102頁。（五）通過構(gòu)建基因文庫分離目的基因基因庫(genepool)基因文庫(genelibraryorgenebank)

基本概念:當(dāng)前44頁，總共102頁。是特定生物體全基因組的集合（天然存在）。基因庫：

當(dāng)前45頁，總共102頁。是從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆形式存在（人工構(gòu)建）?；蛭膸欤寒?dāng)前46頁，總共102頁。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫(genomicDNAlibrary)

cDNA文庫(cDNAlibrary)

當(dāng)前47頁，總共102頁。基因組文庫：

cDNA文庫：含全部基因。含全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因。鳥槍法構(gòu)建；材料來自染色體DNA；cDNA法構(gòu)建；材料來自mRNA；當(dāng)前48頁，總共102頁。1、基因組文庫將某種生物基因組DNA經(jīng)超聲波或限制酶部分酶切處理后，與載體連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因的克隆群體。當(dāng)前49頁，總共102頁。1、基因組DNA的制備：制備的DNA分子量越大，切割后含不規(guī)則末端DNA片段的比率越低，重組率和完備性越高?；蚪M文庫的構(gòu)建為最大限度保證基因的完整性，基因組DNA在分離純化操作中應(yīng)避免過度斷裂。

當(dāng)前50頁，總共102頁。常規(guī)方法制備的染色體DNA長度一般100kb，如先將細(xì)胞固定在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1,000kb的DNA片段。當(dāng)前51頁，總共102頁。一般采用超聲波和限制酶部分酶切法。保證DNA片段大小均一。2、基因組DNA的切割：目的：保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)；當(dāng)前52頁，總共102頁。超聲波處理：

處理后的DNA片段呈平末端，需加裝人工接頭。當(dāng)前53頁，總共102頁。產(chǎn)生粘性末端，可與常用克隆位點(diǎn)（如BamHI、BglII）連接。部分酶切法：部分酶切片段大小可控，可得到15-45kb的隨機(jī)片斷；選用4bp識別序列的限制酶，如Sau3A。當(dāng)前54頁，總共102頁。3、載體和受體的選擇構(gòu)建大型基因組文庫（動植物和人類），選擇BAC或YAC。根據(jù)載體，選擇E.coli、Yeast。常選-DNA或Cosmid；受體：載體：當(dāng)前55頁，總共102頁。當(dāng)前56頁，總共102頁。當(dāng)前57頁，總共102頁。在基因組文庫構(gòu)建中，最應(yīng)引起重視的問題：盡量提高載體與外源DNA片段的連接效率！根據(jù)載體的裝載量，將DNA片段分級分離；利用CIP，去除載體的5’-P；利用TdT，在DNA片段的3’-OH加同聚尾。措施：當(dāng)前58頁，總共102頁?；蛭膸斓耐陚湫裕菏侵冈跇?gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率P，與基因文庫最低所含克隆數(shù)N的關(guān)系：N=ln(1–P)/ln(1–f)P=基因文庫的完備性（某一基因被克隆的概率）f=克隆片段平均大小/生物基因組大小當(dāng)前59頁，總共102頁。N=ln(1–P)/ln(1–f)如：人單倍體DNA長2.9×106kb，克隆片段平均大小15kb，構(gòu)建完備性0.9的基因文庫，至少需45萬個克隆；當(dāng)完備性提高至0.9999時，至少需180萬個克隆。即：為保證某一基因以99.99%的機(jī)率至少被克隆1次，需構(gòu)建含180萬個不同重組克隆的基因文庫，這時克隆片段總和為整個基因組的

倍。9.3當(dāng)前60頁，總共102頁。即：為保證某一基因以99.99%的機(jī)率至少被克隆1次，需構(gòu)建含180萬個不同重組克隆的基因文庫，若1個基因文庫的插入片段總和為整個基因組的10倍以上，就能從基因文庫中調(diào)出任何一段DNA序列。當(dāng)前61頁，總共102頁?；蛭膸斓馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：除盡可能高的完備性外，理想的基因文庫還應(yīng)具備：重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選?？寺】倲?shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量必須大于基因的長度；含有相鄰DNA片段的重組克隆之間，需存在足夠長度的重疊區(qū)，以利于克隆排序；克隆片段易于從載體分子上完整卸下；當(dāng)前62頁，總共102頁?；蚪M文庫的保存影印濾膜保存法保存文庫于液體培養(yǎng)基中保存單個克隆子于液體培養(yǎng)基中當(dāng)前63頁，總共102頁。1）影印濾膜保存法：當(dāng)前64頁，總共102頁。2）保存文庫于液體培養(yǎng)基中從平板上挑取全部克隆，接種于含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長數(shù)代后，加入終濃度25%的甘油，-70℃保存。缺點(diǎn)：由于文庫菌落生長的不均勻性，可能導(dǎo)致文庫中某些特定序列過多或過少。當(dāng)前65頁，總共102頁。3）保存單個克隆子于液體培養(yǎng)基中從平板上挑選單個克隆，接種于含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，菌體生長至一定濃度時，加入終濃度25%的甘油，-70℃保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大。當(dāng)前66頁，總共102頁。從基因組文庫中篩選目的基因大型基因組文庫由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成，除一些具特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因）可用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選）直接篩選外，一般均需多輪操作步驟。當(dāng)前67頁，總共102頁。密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板目的重組克隆鋪板根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進(jìn)行篩選當(dāng)前68頁，總共102頁。通過構(gòu)建基因組文庫獲取目的基因的問題：該方法僅適用于原核基因的分離，較少采用。不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。工作量大，需了解目的基因的背景知識；不能獲得最小長度的目的基因；當(dāng)前69頁，總共102頁。“鳥槍法(shotgun)”：又稱“散彈法”

用限制酶部分酶切染色體DNA將酶切片段克隆入載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞并擴(kuò)增分離帶有目的基因的DNA片段篩選目的重組子當(dāng)前70頁，總共102頁。用“鳥槍法”獲取目的基因：缺點(diǎn)：操作簡便。工作量大；具有一定的盲目性。優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)前71頁，總共102頁。優(yōu)點(diǎn)：保證目的基因的完整性，提高目的重組子的出現(xiàn)頻率，簡化操作。鳥槍法操作的改進(jìn)：

使用特定限制酶完全酶切染色體DNA。前提：已知目的基因的酶切圖譜。策略：用目的基因兩端的限制酶完全酶切染色體DNA，然后與載體拼接。當(dāng)前72頁，總共102頁。2.0kb1.6kb1.8kb如：

已知目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，切下區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠中回收DNA片段，與載體連接。當(dāng)前73頁，總共102頁?；蚪M文庫重組克隆的排序構(gòu)建大型基因組文庫技術(shù)上并不困難，若文庫插入片段總和為基因組的10倍以上，就能從其中調(diào)出任何一段DNA序列。

然而基因文庫的克隆是隨機(jī)序列，必須將所有克隆排列成一個像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。

這項工作的工作量遠(yuǎn)大于文庫構(gòu)建。當(dāng)前74頁，總共102頁。酶切片段末端標(biāo)記法隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法染色體走讀法基因組文庫重組克隆的排序方法：當(dāng)前75頁，總共102頁。酶切片段末端標(biāo)記法：1、將單一YAC克隆插入DNA片段用限制酶均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素。HHHH載體DNA克隆DNA當(dāng)前76頁，總共102頁。2、然后用Sau3A將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片，PAGE電泳，每10個YAC克隆走在一塊板上，形成10個克隆的特征性DNA指紋圖譜。SSSSSSSSSSSSSSSSSSS10克隆指紋圖譜12345678910當(dāng)前77頁，總共102頁。3、電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆DNA的指紋圖譜有部分相同，二者就有互相重疊的可能性，在染色體上則可能是排列一起的。10克隆指紋圖譜12345678910當(dāng)前78頁，總共102頁。隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法：1、將若干YAC克隆固定在薄膜上，復(fù)制20份薄膜；合成20種不同序列的短探針（序列隨機(jī)）。0102030405060708091011121314151617181920A

B

CD

EFG當(dāng)前79頁，總共102頁。2、用20種探針隨機(jī)定位雜交（1對1）20份YAC克隆薄膜。若某2個克隆同時對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這2個克隆有可能相互重疊。0102030405060708091011121314151617181920A

B

CD

EFG20個隨機(jī)探針當(dāng)前80頁，總共102頁。3、若將雜交陽性結(jié)果記為“1”，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序。0102030405060708091011121314151617181920DABCEFG111111111111111111111111111111當(dāng)前81頁，總共102頁。0104120613140214071911150508160310092018DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB當(dāng)前82頁，總共102頁。1、從基因文庫中任取1個克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將其兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在0.5-2.0kb范圍內(nèi)。染色體走讀法(chromosomewalking)：走讀的起點(diǎn)克隆片段亞克隆旁測序列當(dāng)前83頁，總共102頁。2、以亞克隆DNA片段為探針，與基因文庫雜交，陽性克隆中的插入DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的DNA片段連鎖在一起。

走讀的起點(diǎn)克隆片段亞克隆旁測序列探針標(biāo)記第一輪雜交陽性克隆陽性克隆當(dāng)前84頁，總共102頁。3、再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體DNA的端點(diǎn)。陽性克隆陽性克隆第二輪雜交第二輪雜交當(dāng)前85頁，總共102頁。走讀的起點(diǎn)克隆片段當(dāng)前86頁，總共102頁。將某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，與載體連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的克隆群體。

2、cDNA文庫當(dāng)前87頁，總共102頁。信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫，容易構(gòu)建；具有時空性和組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫的特點(diǎn)：不含內(nèi)含子序列；可以在細(xì)菌中直接表達(dá)；包含該生物全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因；當(dāng)前88頁，總共102頁。在高度分化的生物體中，不同組織或細(xì)胞在相同時段、相同環(huán)境背景下，mRNA種類、表達(dá)水平也不同。同一組織或細(xì)胞在不同時段、不同環(huán)境背景下，mRNA種類、表達(dá)水平不同。具有時空性和組織細(xì)胞特異性：當(dāng)前89頁，總共102頁。cDNA文庫特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此具有時空性和組織細(xì)胞特異性。當(dāng)前90頁，總共102頁。cDNA文庫的構(gòu)建總RNA提取mRNA的分離純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成當(dāng)前91頁，總共102頁。1）總RNA提?。荷虡I(yè)化試劑盒。當(dāng)前92頁，總共102頁。利用mRNA含polyA尾，將其從總RNA中分離純化，mRNA只占總RNA的1-2%。2）mRNA的分離純化：

商業(yè)化oligo(dT)纖維素柱。哺乳動物mRNA長度為，大部分為。當(dāng)前93頁，總共102頁