酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座

一、介紹蛋白質(zhì)組成單位-氨基酸氨基酸結(jié)構(gòu)通式

氨基酸（Aminoacid）賦予蛋白質(zhì)特定分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使他分子含有生化活性。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)主要活性分子，包含催化新陳代謝酵素和酶。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第1頁按R基極性不一樣來分類

酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第2頁酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第3頁漢字名稱：絲氨酸英文名稱：serine;Ser定義：學(xué)名：2-氨基-3羥基丙酸。一個脂肪族極性α氨基酸。L-絲氨酸是組成蛋白質(zhì)常見20種氨基酸中一個，是哺乳動物非必需氨基酸，也是生酮氨基酸。在自然界中也有D-絲氨酸，如絲原蛋白中。在一些抗生素中也有D-絲氨酸。符號：S。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第4頁絲氨酸是一個非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸新陳代謝及肌肉生長中發(fā)揮著作用，因為它有利于免疫血球素和抗體產(chǎn)生，維持健康免疫系統(tǒng)也需要絲氨酸。絲氨酸在細(xì)胞膜制造加工、肌肉組織和包圍神經(jīng)細(xì)胞鞘合成中都發(fā)揮著作用。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第5頁氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)

酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第6頁酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第7頁一、目標(biāo)：

學(xué)習(xí)并掌握紙層析法分離判定氨基酸原理和方法。二、原理

紙層析法是用濾紙作為惰性支持物分配層析法，其中濾紙纖維上吸附水是固定相，展層用有機(jī)溶劑是流動相。在層析時，酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第8頁將樣品點在距濾紙一端約2～3cm某一處，該點稱為原點；然后在密閉容器中層析溶劑沿濾紙一個方向進(jìn)行展層，這么混合氨基酸在兩相中不停分配。因為分配系數(shù)（Kd）不一樣，結(jié)果它們分布在濾紙不一樣位置上。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上位置，可用比移值（Rf）來表示。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第9頁所謂Rf，是指在紙層析中，從原點至氨基酸停留點（又稱為層析點）中心距離（X）與原點至溶劑前沿距離（Y）比值。如圖酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第10頁酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第11頁

在一定條件下（如溫度、展層劑組成、層析紙質(zhì)量等不變），某種物質(zhì)Rf值是常數(shù)，所以可作為定性依據(jù)。因為氨基酸無色，可利用茚三酮反應(yīng)使氨基酸層析斑點顯色，從而作定性分析。本試驗利用紙層析法分離氨基酸。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第12頁三、試劑和器材：1.試劑：1.展層劑和平衡液正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分搖勻，用分液漏斗取上層液作展層劑；下層液作平衡液(棄去)。2.樣品液用水配成每ml含有絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml氨基酸溶液，以及上述四種氨基酸混合液(各4mg/ml)。3.茚三酮按展層劑0.25%百分比將茚三酮加入展層劑中，使其溶解。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第13頁試驗器材1.層析缸2.點樣毛細(xì)管3.小燒杯4.培養(yǎng)皿5.量筒6.噴霧器7.吹風(fēng)機(jī)（或烘箱）8.層析濾紙9.直尺及鉛筆酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第14頁四、試驗步驟1.準(zhǔn)備濾紙：取寬約16cm、高約16cm層析濾紙一張。在紙下端距邊緣2cm處用鉛筆劃一直線A，在直線上做5個記號，記號之間間隔2cm，標(biāo)出5個點，這就是原點位置。另在距左邊緣1cm處畫一條平行于左邊緣直線B，在B線上以A、B兩線交點為原點標(biāo)明刻度（以厘米為單位）。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第15頁2.點樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品點在5個原點上，用量10～20μl，每點在紙上擴(kuò)散直徑，最大不超出3mm，邊點樣邊用電吹風(fēng)吹干，越小越好。干后再點一次。3.層析：將平衡好濾紙，放入層析缸底部接觸展層劑液面，展層劑不可浸沒樣點，展層劑抵達(dá)濾紙頂部邊緣約0.5cm處停頓層析（層析時間2h左右）。然后取出層析濾紙，標(biāo)好前沿，放入烘箱中45℃烘干。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第16頁4．顯色用噴霧器均勻噴上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘(100℃)或用熱風(fēng)吹干即可，濾紙上即顯出紫紅色或黃色氨基酸斑點。5．計算各種氨基酸Rf值。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第17頁五、注意事項在操作過程中，手不要摸濾紙。點樣直徑不超出3mm。點樣一端朝下,擴(kuò)展劑液面需低于點樣線1cm。即時取出濾紙,以免出現(xiàn)氨基酸層析跑到濾紙外面不能檢測。酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第18頁

吸樣后毛細(xì)管要垂直落在層析紙點樣處，樣點大小要基本一致；

樣點不要浸在展開劑中；

噴顯色劑時，使層析紙濕潤即可，切勿流淌，并快速吹干；

在層析紙制作、點樣、顯色、吹干及值測定

等操作過程中，手只能拿在最上端，以防被手

沾污。

酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第19頁六、思索題⑴層析紙上樣品斑點浸在展開劑中是否能夠？為何？⑵懸掛層析紙為何不能接觸層析缸壁？酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)絲氨酸的分析鑒定專家講座第20頁不能夠。因展開劑會稀釋、溶解樣品，或