蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座

蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第1頁(yè)蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第2頁(yè)雙向電泳介紹2-DE是當(dāng)前唯一個(gè)能夠僅經(jīng)過(guò)一次操作解析上千種蛋白質(zhì)技術(shù)。第一向—等點(diǎn)聚焦(IEF)pH梯度載體pI第二向—十二烷基硫酸鈉(SDS) SDS作為變性劑和助溶劑分子量蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第3頁(yè)樣品等點(diǎn)聚焦(第一向)雙向電泳基本原理與流程示意分子量pH梯度(pI)SDS兩性電解質(zhì)pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第4頁(yè)雙向電泳詳細(xì)步驟樣品制備緩沖液配制IPG條重泡漲及上樣第一向：IEFIPG條平衡平衡緩沖液Ⅰ(還原)平衡緩沖液Ⅱ(巰烷基化)第二向：SDS膠條染色成像及圖像分析蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第5頁(yè)為何要進(jìn)行樣品制備當(dāng)前雙向電泳普通只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(spot)，而樣品中蛋白種類(lèi)可到達(dá)10萬(wàn)種以上。待研究樣本(如臨床樣本)常是各種細(xì)胞和組織混雜，而蛋白質(zhì)組研究通常是單一細(xì)胞類(lèi)型。？蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第6頁(yè)1確保樣品蛋白質(zhì)完全溶解，分級(jí)效果好，干擾原因少盡可能使全部待分析蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包含多數(shù)疏水性蛋白）。防止樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中核酸和一些干擾蛋白。盡可能去除起干擾作用高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而確保待研究蛋白可檢測(cè)性。經(jīng)過(guò)超離心去除全部顆粒狀物質(zhì)，預(yù)防其堵塞凝膠孔路。2最大程度降低樣品損失低溫保留樣品(普通需低于-86℃)盡可能縮短處理時(shí)間除鹽，省略無(wú)須要過(guò)程確保樣品在聚焦時(shí)不發(fā)生蛋白聚集和沉淀。樣品制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第7頁(yè)樣品制備流程及注意事項(xiàng)溶解預(yù)處理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分級(jí)富集除雜蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第8頁(yè)樣品破碎標(biāo)準(zhǔn)－最小程度降低蛋白水解和其它形式蛋白降解樣品起源易碎細(xì)胞堅(jiān)硬組織植物細(xì)胞真菌方法溫和猛烈蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第9頁(yè)溫和破碎法滲透壓沖擊(培養(yǎng)細(xì)胞)低滲液中懸浮細(xì)胞重復(fù)凍融法(細(xì)菌)液氮冷凍去污劑降解(酵母、霉菌)降解緩沖液(含尿素和去污劑)SDS(應(yīng)在IEF前往除)酶降解(植物、細(xì)菌、真菌)溶菌酶(細(xì)菌)纖維素酶，果膠酶(植物)溶壁酶(酵母)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第10頁(yè)猛烈破碎法超聲破碎(細(xì)胞懸浮液)需以冰涼卻防止過(guò)熱弗式細(xì)胞壓碎器(Frenchpressurecell，帶壁微生物細(xì)胞在剪切力作用下破碎研磨(固體組織，微生物)液氮中將固體組織磨成細(xì)粉末樣品研磨器(用于少許樣品處理)用于準(zhǔn)確樣品珠磨法(胞懸液，微生物)經(jīng)過(guò)磨珠研磨破壞細(xì)胞壁蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第11頁(yè)作用去除雜質(zhì)濃縮樣品抑制蛋白酶活性關(guān)鍵-可溶性取得能夠重新溶解蛋白慣用方法硫酸銨沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸銨/甲醇/苯酚抽提樣品沉淀

對(duì)于疏水性尤其強(qiáng)蛋白如膜蛋白硫脲SDS新型兩性表面活性劑(如磺基甜菜堿)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第12頁(yè)樣品中雜質(zhì)去除去除標(biāo)準(zhǔn)盡可能不丟失蛋白降低蛋白修飾雜質(zhì)主要種類(lèi)DNA/RNA脂質(zhì)多糖鹽離子去污劑其它固體雜質(zhì)

蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第13頁(yè)DNA/RNA去除樣品中含核酸不利影響能被銀染色法染色在凝膠酸性部分產(chǎn)生水平條紋當(dāng)樣品抵達(dá)IEF凝膠酸性端時(shí)，與蛋白質(zhì)一同沉淀去除方法蛋白沉淀法DNase/RNase處理超聲(機(jī)械破壞)、超高速離心DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第14頁(yè)其它雜質(zhì)去除脂質(zhì)使蛋白質(zhì)不易溶解且會(huì)影響其分子量及pI丙酮沉淀多糖阻塞膠體，影響蛋白質(zhì)沉淀、聚焦TCA、硫酸銨或醋酸銨/甲苯/苯酚沉淀；超速離心和高pH鹽使膠條導(dǎo)電能力增強(qiáng)，共聚焦不易發(fā)生透析；膠體過(guò)濾；沉淀或重新懸浮離子去污劑如SDS，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電不能聚焦丙酮沉淀；將含SDS蛋白溶于含兩性或非離子去污劑如CHAPS，TritonX-100，NP-40等緩沖液中并使SDS終濃度＜0.25%固體雜質(zhì)阻塞膠體，影響蛋白質(zhì)沉淀、聚焦過(guò)濾蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第15頁(yè)樣品溶解2-DE成功分離蛋白質(zhì)最關(guān)鍵原因之一溶解目標(biāo)樣品中非共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽溶解液（不然樣品中結(jié)合牢靠蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新蛋白點(diǎn)，對(duì)應(yīng)表示單個(gè)多肽點(diǎn)強(qiáng)度會(huì)下降）溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離鹽、脂類(lèi)、多糖和核酸等物質(zhì)去除溶解方法要確保樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第16頁(yè)增加樣品溶解性伎倆變性劑改變氫鍵結(jié)構(gòu)，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿表面活性劑溶解疏水基團(tuán)離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS等還原劑使變性蛋白深入伸展溶解含自由巰基DTT或-巰基乙醇，不帶電荷磷酸三丁酯(TPB)起載體作用兩性電解質(zhì)抵達(dá)平衡位置形成pH梯度，“運(yùn)載”電流、pH捕捉樣品中少許鹽分濃度應(yīng)小于0.2％（w/v，濃度過(guò)高會(huì)使IEF速度降低)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第17頁(yè)樣品液準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL0.1%原液0.0002%溴酚藍(lán)見(jiàn)下表0.2%兩性電解質(zhì)載體385mgDTT或500uL200mMTBP原液50mMDTT或2mMTBP24g尿素加入25mLH2O8M尿素用量試劑蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第18頁(yè)IPG

用兩親性電解液組成250l25l20%8-10125l12.5l40%7-97-10250l25l40%5-85-8125l12.5l40%4-6250l25l40%3-53-6125l12.5l40%5-7125l12.5l40%4-64-7250l25l40%3-103-10樣品溶液體積(/5ml)樣品溶液體積(/5ml)兩親性電解液濃度(w/v)兩親性電解液范圍IPG膠pH范圍蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第19頁(yè)樣品制備注意事項(xiàng)

蛋白質(zhì)水解低溫Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)蛋白抑制劑特殊樣品制備低豐度蛋白分離預(yù)分級(jí)窄pH膠(<2個(gè)pH單位)強(qiáng)堿性蛋白(如核糖體)處理預(yù)處理富集特殊pH梯度IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦極端分子量蛋白處理小于8kD對(duì)流混合，產(chǎn)生絨毛狀或含糊帶大于200kD蛋白，變性為多肽蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第20頁(yè)梯度器塑料支持膜固定pH梯度(ImmobilizedpHGradient,IPG)膠條制備ACBFED酸堿

pH3pH10蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第21頁(yè)固定pH梯度(IPG)示意圖聚丙烯酰胺凝膠CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺單體酸緩沖基團(tuán)：堿緩沖基團(tuán)：NH3+R

蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第22頁(yè)寬pH梯度及窄pH梯度寬pH梯度用于：

全部蛋白(確定感興趣蛋白大致位置)窄pH梯度用于：

提升分辨率增加載樣能力以檢測(cè)、分析更多蛋白

蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第23頁(yè)IPG膠重泡漲及上樣2-DE樣品重泡漲溶液重泡漲溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG緩沖液

(兩親性電解液)0.28%DTT微量

溴酚藍(lán)IPG膠條支架IPG

膠條定位泡漲目標(biāo)：使樣品能完全以可溶形式進(jìn)入IPG膠條內(nèi)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第24頁(yè)蛋白載樣量IPG膠條對(duì)蛋白載樣量影響原因：待分析蛋白點(diǎn)量應(yīng)滿(mǎn)足隨即質(zhì)譜分析待研究蛋白豐度樣品復(fù)雜度復(fù)雜度較高樣品，為了盡可能了解所包含每種蛋白，需要重復(fù)試驗(yàn)才能完成。假如將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條pH范圍預(yù)試驗(yàn)確定先寬后窄先線性后非線性先短后長(zhǎng)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第25頁(yè)第一向：等點(diǎn)聚焦1.放置電極墊

(?)2.200V

維持

1.5h3.500V維持

1.5h

4.1000V梯度上升

1500vh5.8000V梯度上升

(?)36000vh時(shí)間電壓支架蓋IPG

膠條電極電極墊蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第26頁(yè)IPG

膠條平衡

平衡液6M尿素和30%甘油降低電內(nèi)滲第一步平衡加DTT使變性非烷基化蛋白處于還原狀態(tài)第二步平衡加碘乙酰胺使蛋白質(zhì)巰烷基化，預(yù)防其在電泳過(guò)程中重新氧化蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第27頁(yè)

使被分離蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合第二向:SDS

SDS平衡SDSSDS平衡液50mMTris-HCl6M尿素30%丙三醇2%SDS微量

溴酚藍(lán)SDSSDSSDS向電泳緩沖液中加

0.5%瓊脂糖SDS標(biāo)識(shí)紙片IPG膠條蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第28頁(yè)膠體考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍可實(shí)現(xiàn)PAGE無(wú)背景染色會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析結(jié)果胺基黑染色轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上蛋白質(zhì)染色轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上蛋白質(zhì)染色銀染可降低膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量對(duì)一些種類(lèi)蛋白質(zhì)染色效果差對(duì)其后蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響染色方法蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第29頁(yè)銀染色50%甲醇25%乙酸4hddH2O洗3次30min/次0.004%DTT溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30sec3%Na2CO30.0185%甲醛2.3M檸檬酸5%乙酸25%甲醇蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第30頁(yè)負(fù)染主要包含金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等使用能專(zhuān)門(mén)提升PAGE膠上蛋白質(zhì)回收率速度快（5~15min）且能保持蛋白質(zhì)生物活性不能用于膜上染色適合用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析膠體擴(kuò)散染料主要包含印度墨水染料、膠體金屬染料等高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上蛋白質(zhì)靈敏度與PAGE膠內(nèi)銀染類(lèi)似不用于膠內(nèi)染色染色方法蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第31頁(yè)有機(jī)熒光團(tuán)染料包含共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合熒光團(tuán)染料兩類(lèi)，后者最為慣用，其經(jīng)典代表是已經(jīng)商品化SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成靈敏度為2~10ng其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來(lái)判定蛋白質(zhì)金屬螯合染料與當(dāng)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容專(zhuān)門(mén)與慣用微量化學(xué)表征過(guò)程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很輕易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包含自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合染色方法蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第32頁(yè)凝膠圖像處理分析經(jīng)典流程凝膠圖像掃描圖像加工斑點(diǎn)檢測(cè)和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)建立2-DE分離可溶性

E.coli蛋白蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第33頁(yè)當(dāng)前雙向電泳需處理問(wèn)題樣品制備及溶解不溶性蛋白(膜蛋白及核內(nèi)蛋白)難分離蛋白(如毛發(fā)及皮膚中蛋白)載樣量提升初步分離低豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白定量分析靈敏度及可重復(fù)性蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第34頁(yè)對(duì)于雙向電泳提議首先采取寬pH范圍膠條，確定蛋白分布范圍，通常采取pH3-10膠條假如pH線性分布膠條分離效果不好，可采取非線性膠條加大蛋白上樣量，提升局部蛋白分辨率采取窄pH范圍膠條，提升某pH范圍蛋白分辨率第二向采取梯度膠進(jìn)行分離去除高豐度蛋白，進(jìn)行蛋白分級(jí)處理，富集低豐度蛋白蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第35頁(yè)蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第36頁(yè)質(zhì)譜基礎(chǔ)

樣品離子源質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器固體液體蒸汽形成離子(帶電分子)電離質(zhì)量分選(過(guò)濾)檢測(cè)依據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜檢測(cè)離子基本步驟:1.樣品離子化2.依據(jù)質(zhì)量(m/z)不一樣分離離子3.檢測(cè)每種質(zhì)量離子數(shù)目4.搜集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第37頁(yè)質(zhì)譜評(píng)價(jià)指標(biāo)質(zhì)量范圍速度靈敏度分辨率準(zhǔn)確度蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第38頁(yè)+++自由漂移區(qū)檢測(cè)器基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)樣品探針激光335nmm/z相對(duì)強(qiáng)度MH+MH+MH+特點(diǎn)：靈敏度高準(zhǔn)確度高分辨率高質(zhì)量范圍廣圖譜簡(jiǎn)明速度快蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第39頁(yè)ESI四級(jí)桿質(zhì)量分析器碰撞室反射器MCP檢測(cè)器碰撞氣體串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)ESI-Q-TOF質(zhì)譜儀步驟：1質(zhì)量分析

2碰撞(離子裂解)3質(zhì)量分析TOF質(zhì)量分析器蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第40頁(yè)強(qiáng)抗背景干擾能力極高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度可用來(lái)分析復(fù)雜混合物中蛋白質(zhì)豐富檢測(cè)信息，高通量判別蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜優(yōu)點(diǎn)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第41頁(yè)1、判定和注釋蛋白質(zhì)路線

經(jīng)過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配經(jīng)過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)判定鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第42頁(yè)

1234.5396

783.9147375.2561多肽已測(cè)得質(zhì)譜數(shù)據(jù)或理論質(zhì)譜數(shù)據(jù)MALDI-TOF檢測(cè)多肽指紋

胰酶消化凝膠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)?123比較:??是否相同

??質(zhì)譜3235.2256蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第43頁(yè)

肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配

不成功可能原因樣品量太少，PMF圖信噪比太低，輸入庫(kù)中搜尋數(shù)據(jù)質(zhì)量不好。2-DE膠上所取一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)并非單一蛋白質(zhì)，所獲PMF圖實(shí)際上是兩個(gè)以上蛋白質(zhì)混合圖。蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第44頁(yè)

操作中角蛋白或其它蛋白質(zhì)污染蛋白質(zhì)發(fā)生了較多轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫(kù)中未有記載所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自酶解片段多未知新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模太小續(xù)：蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第45頁(yè)氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)？查詢(xún)串聯(lián)質(zhì)譜圖從頭測(cè)序輸入輸出序列片段PNT①②③串聯(lián)質(zhì)譜判定多肽計(jì)量方法蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第46頁(yè)組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉(zhuǎn)換盤(pán)旋共振質(zhì)譜（FTMS）表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）聯(lián)合技術(shù)準(zhǔn)確判定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第47頁(yè)2、基于生物質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組研究策略

原理：對(duì)于含有相同離子化能力蛋白質(zhì)或多肽，能夠經(jīng)過(guò)比較質(zhì)譜峰強(qiáng)度（或峰面積）得到待比較蛋白質(zhì)相對(duì)量。

蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第48頁(yè)3、基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)相互作用研究方法靶蛋白制備蛋白質(zhì)復(fù)合體純化蛋白質(zhì)復(fù)合體質(zhì)譜判定基本步驟：蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第49頁(yè)(1)親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

基本原理：將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用蛋白質(zhì)細(xì)胞裂解液過(guò)柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上蛋白質(zhì)，最終用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MDLC-ESI-MS/MS）判定靶蛋白結(jié)合蛋白。蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第50頁(yè)先決條件得到足夠多保持生物活性重組靶蛋白作為誘餌（bait）

取得足夠量、純度高與誘餌相互作用蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第51頁(yè)利用含靶蛋白融合蛋白取得

相互作用蛋白質(zhì)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白蛋白A融合蛋白蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第52頁(yè)主要優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高：高濃度靶蛋白候選蛋白質(zhì)與靶蛋白結(jié)合機(jī)會(huì)均等檢測(cè)多亞基蛋白質(zhì)之間相互作用蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第53頁(yè)(2)免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

原理：以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜判定靶蛋白結(jié)合蛋白。

蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第54頁(yè)研究鼻咽癌細(xì)胞系中p53相互作用蛋白抗p53抗體與HNE1和HNE2總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀SDS分離免疫沉淀復(fù)合物切取p53結(jié)合蛋白條帶，酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）分析，得到對(duì)應(yīng)肽序列標(biāo)簽搜索數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)家講座第55頁(yè)特點(diǎn)

生理?xiàng)l