高中生物復習選修3《現(xiàn)代生物科技專題》專題研修人教版（word 版）

專題1基因工程基因工程是指按照人們的愿望進行嚴格的設計并通過體外DNA重組轉(zhuǎn)基因等技術(shù)賦予生物以新的遺傳特性從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平進行設計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)科技探索之路基礎理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程20世紀中葉，基礎理論取得了重大突破●DA是遺傳物質(zhì)的證明194年，艾弗里等人通過不類型肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗，不僅證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體●DA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法的確立193年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型198年，梅塞爾松和斯塔爾實驗證明DNA的半保留復制隨后不久確立的中心法則，解開了DA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程之謎，闡明了遺傳信息流動的方向?！襁z傳密碼的破譯193年，尼倫伯格和馬太破編碼氨基酸的遺傳密碼。1966年，霍拉納用實驗證實了尼倫伯格提出的遺傳密碼的存在。這些成果不僅使人們認識到，自然界中從微生物到人類共用一套遺傳密碼，而且為基因的分離和合成等提供了理論依據(jù)。技術(shù)發(fā)明使基因工程的實施成為可能●基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)197年，羅思和赫林斯基發(fā)細菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復制能力，并可以細菌細胞間轉(zhuǎn)移，這一發(fā)現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)移找到了一種運載工具?！窆ぞ呙傅陌l(fā)現(xiàn)190年阿爾伯內(nèi)森斯史密斯在細菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制性內(nèi)切（簡稱限制酶后20世紀70年代初相繼發(fā)現(xiàn)了多種限制酶和連接酶，以及逆轉(zhuǎn)錄酶，這些發(fā)現(xiàn)為DA切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。●DA合成和測序技術(shù)的發(fā)明自165年桑格發(fā)明氨基酸列分析技術(shù)后197年科家又發(fā)明了DA序列分析的法為基因序列圖的繪制提供了可能，之后，DA合成的問世又為引物探針和小分子量DNA基因的獲得提供了便。●DA體外重組的實現(xiàn)192年伯格首先在體外進行了DN改造的研究，成功地構(gòu)了第一個體外重組DA分子重組DNA表達實驗的成功193年，博耶和科恩選用僅單一EcRI酶切位點的載體粒pS11，使之與非洲爪蟾糖體蛋白基因的DNA片段重組。重組的DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DNA中，轉(zhuǎn)錄出相應的mNA這個實驗證明了①質(zhì)粒不僅可以作為基因工程的載體，重組DNA還可以進入受體細胞外源基因可以在原核細胞中成功表達并實現(xiàn)物種之間的基因交流至此基因工程正式問第一例轉(zhuǎn)基因動物問世190年，科學家首次通顯微注射培育出世界上第一個轉(zhuǎn)因小鼠。193年，科學家又用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。此后，基因工程進入了迅速發(fā)展階段。PCR故術(shù)的發(fā)明基因工程問世后，198年由里斯發(fā)明的PR技術(shù)，使基工程技術(shù)得到了進一步發(fā)展和完善。PAGEPAGE21.1 DNA重組技術(shù)的基本工具我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育，首先要在體外對含有抗蟲基因的DA分進行“切割、改造、修飾和“拼接，然后，導入棉花體胞內(nèi)，并使重組DA在細胞表達限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”切割DA的工具是限制性核內(nèi)切酶，又稱限制酶。這類主要是從原核生物中分離純出來的。它們能夠識別雙鏈DA分子的某種特定核苷酸序列并且使每一條鏈中特定位的兩個核苷酸之間磷酸二酯鍵斷大多數(shù)限制酶的別序列由6個核苷酸組成，例如，coI、mI限制酶識別的序均為6個核苷酸，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4、5或8個核苷酸組成DA分子經(jīng)限制切割產(chǎn)生的DA片段末端通有兩種形式—黏性末端平端當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將NA的兩條鏈別切開時產(chǎn)生的是黏性末端而當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時產(chǎn)生的是平末端。尋根問底：根據(jù)你所掌握的知識，你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？提示原核生物容易受到自然界外源DA的入侵限制酶是細菌的一種防御性工具限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從達到保護自身的目的。生物技術(shù)資料卡：限制酶的命名用生物屬名的頭一個字母與種名的頭兩個字母組成了3個母的略語以此來表示這個酶是從哪個生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌（Eshrcioi）的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R菌株中分離出來的第一個限制酶，則進一步表示成EcoRIDNA連接酶——“分子縫合針”將切下來的DA片段拼接成的DA分子是靠NA連接來完成的根據(jù)酶的來源不同可以將這些酶分為兩類一類是從大腸桿菌中分離得到稱為EcliDA連接酶另一類是從T4噬菌體中分離來的稱為T4NA連接酶兩類酶都是將雙鏈DA片段“縫”起來，恢復被限制酶切開兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E·clNA連接酶只能將鏈DNA片段互補黏性末端之連接起來。而T4DA連接酶可以“縫合”雙鏈DNA片段補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DA片段的平末端，但連平末端之間的效率比較低尋根問底：DA連接酶與DA聚合酶是一回事嗎？為什么？提示（1）DNA聚合酶只能單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷二酯鍵。（2DA聚合酶起作用時需以一條DA鏈模板而DA連接酶是將DA雙鏈上的兩缺口同時連接起來因此DNA連接酶不需要模板思考：想一想，具備什么條件才能充當“分子運輸車”？提示自我制有一或個切割點有記基位點及對受體細胞無害等。因進入體細的載—分子輸”通常是利質(zhì)粒作為載基因送入細胞質(zhì)粒是一種裸露的結(jié)構(gòu)簡單獨立于細菌擬核DA之外并具自我復制能力的很小的雙環(huán)狀DA分子質(zhì)粒DA分子上有一個至多限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中攜帶外源DA片段的質(zhì)粒進受體細胞后在細胞中進行自我復制或整合到染色體DNA上隨染色體NA進行同步復制。質(zhì)粒DNA分子上有特殊的標記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎上進行過人工改造的。2.聯(lián)系你已有的知識，想一想，為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA?提示：生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。3.天然的DA分子可以直接做基因工程載體嗎？提示：自然存在的質(zhì)粒DA子并不完全具備作為運載體的條件，都要進行人工改造后能用于基因工程操作。1.2 基因工程的基本操作程序求異思維：你能推測出由mNA反轉(zhuǎn)錄形成cA的過程大分為哪些步驟嗎？提示：第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以A為模板合成一條與RNA互的DNA單鏈，形成N-NA交分子。第二步，核酸酶H使RADA雜交分子中的RA鏈降解使之變成單鏈的DA第三步以單鏈NA為模在DNA聚合酶的作用下合成一條互補的DA鏈，形成雙鏈DA分子目的基因的獲取獲取目的基因是實施基工程的第一步目的基因可以從自然界中已有的物種中分出來也可以用人工的方法合成。目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因例如與生物抗逆性相關的基因與優(yōu)良品質(zhì)相關的基因與生物藥物和保健品相關的基因、與毒物降解相關的基因，以及與工業(yè)所需用酶相關的基因等，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫基因文庫就像一座圖書館每一個基因就是一本書如果一座“圖書館”中包含了一種生物所有的基那么我們就可以說這個基因文庫很大就像國家圖書館這種基因文庫叫做基因組文庫也有一些基因文庫比較小就像某個市或某個單位的圖書館，只包含了一種生物的一部分基，這種基因文庫叫做部分基因文庫，如cDNA文庫怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢？這還是一件比較復雜的事情簡單地說就是根據(jù)目的基因的有關信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mNA，以及基因表達產(chǎn)物蛋質(zhì)等特性來獲取目的基因。?尋根問底：為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PR方式從含有該基因的生的DA中，直接獲得。也可通過反轉(zhuǎn)錄，用PR方式從NA中獲得，不一定要構(gòu)建基文庫但如果所需要的目的基因的序列完全不知或只知道目的基因序列的一段或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因或想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。生物技術(shù)資料卡因文的建將某種生物體內(nèi)的DNA全部取出來，選用適當制酶將DNA切成一定范圍大小的NA片段，然后，將這些DA片段分別載體連接起體菌群體中儲存每受體菌都含有了一段不同的DA片段也就是說這個群體含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。如果用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補NA(也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫。文庫類型cDA文基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以利用PCR技術(shù)擴增目的基因CR多聚酶鏈式反應縮寫。PCR是一項在生物外復制特定DNA片段的核酸合技術(shù)。通過這一技術(shù)，可以在短時間內(nèi)大量擴增目的基因PCR的原理和做法并不難，是利用DNA雙鏈復制的原理將基因的核苷酸序列不斷地加以復制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。利用PR技術(shù)擴增的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，便根據(jù)這一序列合成引物擴增的過程是：目的基因DA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環(huán)多次。由于延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴增（約為2n,其中n為擴增循環(huán)的次數(shù))。上述過程可以在PCR擴增儀中自動完成。此外，如果基因比較小核苷酸序列又已知，也可以通過A合成儀用化學方法直接人工合成基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。因此，一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子以標記基因等啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要蛋白質(zhì)。終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要地方停止下來。終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DA短片段。標記基因的用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，如抗素抗性基因就可以作為這種基因。尋根問底：將生物的所有DA直接導入受體細胞不是更簡單嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？提示有人采用總NA注射進行遺傳轉(zhuǎn)化即將一個生物中的總DA提取出來通過射或花粉管通道法導入受體植物沒有進行表達載體的構(gòu)建這種方法針對性差完全靠運氣也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物此法目前爭議頗多，嚴格來講不算基因工程。將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物能在自然條件下感染雙子葉植物裸子植而大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力當植物體受到損傷時傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞，這時農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并且整合到受體細胞染色體的DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這種特點，如果將目的基因插入到Ti質(zhì)的T-NA上，通過農(nóng)桿菌的化作用，就可以使目的基因進入植物細胞并將其插入到植物細胞中染色體的DA上使的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達由于這種方法比較經(jīng)濟和有效，迄今為止，約8%轉(zhuǎn)基因植物都是通過這種方法獲得的。除此之外，還有基因槍法和花粉管通道法等?；驑尫ǎ夯驑尫ㄓ址Q微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中使目的基因與其整合并表達的方法常用的金屬顆粒有鎢粉粒子金粉粒子是單子葉植物中常用的一種因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高?；ǚ酃芡ǖ婪ǎ哼@我國科家獨創(chuàng)的一種方法。在植物受粉后，花粉形成的花粉管還愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DA(目的基因)使的基因借助花粉管通道進入受體細胞我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的花粉管通道法是一種十分簡便經(jīng)濟的方法。將目的基因?qū)雱游锛毎镜牟僮鞒绦蚴牵菏紫葘⒑心康幕虻谋磉_載體提純并使DA濃度保持在l～3mmL；然后，從雌性動物體內(nèi)取出卵(卵可以在體內(nèi)受精可以在體外受精采用顯微射儀進行顯微注射再將注了目的基因的受精卵經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)一段時間后，再移植雌性動物的輸卵管子宮內(nèi)使其發(fā)育成為具有新性狀的動物。將目的基因?qū)⑸锛毎捎谠松锞哂幸恍┢渌餂]有的特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少等，因此，早期的基因工程操作都用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌應用最為泛。大腸桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是首先用Ca2+處理細胞細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)這種細胞稱為感受態(tài)細胞第步是將重組表達載體DA分溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞合在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。目的基因的檢測與鑒定首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DA上是否插入了目的基因這目的基因能否在受體細胞中穩(wěn)定遺傳的關鍵檢測方法是采用DA分子雜交技術(shù)，即轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA提出來，在含有目的基因的DA片段上用放射性同位素等作記，以此作為探針，使探針與基因組DA雜交，如果顯示雜交帶，就表明目的基因已插入色體DA中其次，還需要檢測目的因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，這是測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步。檢測方法同樣是采用分子雜交技術(shù)與上述方法不同之處是從轉(zhuǎn)基因生物中提取的是mNA標記的目的基因作探針與mRA雜交如果示出雜交帶，則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mNA最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測的方法與上述方法有所不同是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)用相應抗體進行抗原一抗體雜交，若雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。除了上述的分子檢測外，有時還需要進行個體生物學水平鑒定。例如，一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛毎?，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性需要做抗蟲或抗病的接種實驗以確定是否具有抗性以及抗性的程度又如有的因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進行活性比較，以確定轉(zhuǎn)基產(chǎn)品的功能活性是否與天然品相同。1.作為基因工程表達載體，需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？答不可以因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用還需要有其他控制元件如啟動子終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：①生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的動子才能比較有利于基因的表達；②通過cDNA文庫獲得的目的因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；③目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；④為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等；⑤有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位往往要加上可以標識存在部位的基（或做成目的基因與標識基因的融合基因，如綠色熒光蛋白基因等2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因入雙子葉植物的機理你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？若想將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物，如小麥，從理論上說，你應該如何做？提示：雙子葉植物對根瘤農(nóng)桿菌敏感。裸子植物對該菌也敏感。近年來，也有報道該菌對單子葉植物也有侵染能力。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性即植物的受傷組織會產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌受傷組織集中這些酚類物質(zhì)通常不存在于單子葉植物中這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉(zhuǎn)化時是需要加上述酚類物質(zhì)的同時單子葉植種類不同農(nóng)桿菌侵染進行遺傳轉(zhuǎn)化的效果也有很大差異。如果想將一個抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥也可以用農(nóng)桿菌但要注意兩點①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物②要加趨化和誘導的物質(zhì)目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠（趨化性和激活農(nóng)桿菌的Vr區(qū)（誘導）的因，使TDA轉(zhuǎn)移并插入染色體DNA上3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出的胰島素聯(lián)系前面有關細胞器功能的知識結(jié)合基因工程操作程序的基本思路思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？提示有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體上加工完的大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？提示：基本操作如下：①從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDA②將cNA前接上在大腸桿菌可以適用的啟動子，另外加抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達載體。③將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸菌如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基已進入其中。④培養(yǎng)進入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎從中提取β-珠蛋白。拓展視野：歷史不能忘記中科學家對PR的貢將PR變成真正成熟技術(shù)的臨門一腳”,則是中國科學家嘉韻完成的，是她發(fā)現(xiàn)并分離了耐高溫的DNA聚合酶。錢嘉韻是我國臺灣的科學家，她是第一個報道分離耐高溫DA聚合酶工作的。知識拓展1.基因工程載體的構(gòu)建需要慮哪些方面的因素？道理何在？①基因的特點如果一個來自動物的目的基因含有內(nèi)含子就不能用于轉(zhuǎn)基因植物因動物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA?；虻漠a(chǎn)物如是一個糖蛋白，那么該基因在原核生物細菌中表達出來的蛋就可能不具備天然狀態(tài)下的活性因為糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體上加上的而細菌無這些細胞器。②要選擇強啟動子或組織特異性啟動子啟動子有強有弱選擇強啟動子可以增加轉(zhuǎn)錄性使基因產(chǎn)物量增多如果希望基因在生物的某個組織表達，如只在植物種子中表達，就要選擇種子中特異表達的動子。③要有選擇標記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物。2.什么是分子雜交技術(shù)的顯帶？Soten雜交─DA和DA分子之間的雜交目的基因是否整合到受體生物的染色體DA中這在真核生物中是目的基因可否穩(wěn)定存在和遺傳的關鍵。基本做法是：第一步，將受體生物DA提出來，經(jīng)過適當?shù)拿盖泻螅攮傊悄z電泳，將不同大小的片段分開；第二步，將凝膠上的DA片轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第三步，用標記了放射性同位素（或生物素）的目的A段作為探針與硝酸纖維素膜的DA進雜交第四步，將X光底片壓在硝纖維素膜上，在暗處使底片感光第五步，將X光底片沖洗，果在底片上出現(xiàn)黑色條帶，則表明受體植物染色體DNA上有目的基因Noten雜交─DA和RA分子之間的雜交它是檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mNA的方具體做法與Suhn雜交相同，只是第一步從受體植物中提取的是mRNA而不是DA雜交帶的顯現(xiàn)也與Suhrn交相同。Wetn雜交──蛋白質(zhì)分（抗原—抗體之間的雜交它是檢測目的基因是否表達出蛋白質(zhì)的一種方法具體做法是：第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達出蛋白質(zhì)；第二步，將表達出的蛋白質(zhì)注射動物進行免疫，產(chǎn)生相應的抗體，并提取出抗體（一抗；第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；第四步，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第五步將抗（一抗與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交這時抗（一抗與目的基因表達的蛋（抗原會特異結(jié)合。由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶所以加入一種稱為二抗的抗體它可以與一抗結(jié)合二抗抗體上帶有特殊的標記。如果目的基因表達出了蛋白質(zhì)，則結(jié)果為陽性。1.3 基因工程的應用一、植物基因工程碩果累累植物基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能(如抗除劑抗蟲抗病抗干旱和抗鹽堿等以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面。1、抗蟲轉(zhuǎn)基因植物對農(nóng)業(yè)害蟲的防治大多是依靠化學農(nóng)藥大量使用化學農(nóng)藥不僅造成了嚴重的環(huán)境污染損害了人類健康而且大大增加了生產(chǎn)成本因此從某些生物中分離出具有殺蟲活性的基因?qū)⑵鋵胱魑镏惺蛊渚哂锌瓜x性已成為防治作物蟲害的發(fā)展趨勢用于殺蟲的基因主要是Bt毒蛋白因白抑制劑因粉酶制劑因物凝集基因等如，我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是轉(zhuǎn)入Bt蛋白基因培育出來的，它對棉鈴蟲具有較強的抗性。Bt毒蛋白基因是從蘇云金芽桿菌中分離出來的抗蟲基因。當害蟲食用含有轉(zhuǎn)基因的植物時，Bt基因編碼的蛋白質(zhì)會進入害蟲的腸道在消化酶的作用下蛋白質(zhì)能夠降解成相對分子質(zhì)量比較小的有毒的多肽多肽結(jié)合在腸上皮細胞的特性受體上，會導致細胞膜孔，細胞腫脹裂解，最后造成害蟲死亡。由于Bt毒蛋白對乳動物無毒害作用，因而廣泛用于抗蟲轉(zhuǎn)基因植物。蛋白酶抑制劑基因廣泛存在于植物中它產(chǎn)生白酶制劑可與害蟲消化道中的蛋白結(jié)合形成復合從而阻斷或降低蛋白酶的活性使昆蟲不能正常消化食物中的蛋白質(zhì)這種復合物還能剌激昆蟲分泌過量的消化酶引起害蟲的厭食反應。淀粉酶抑制劑基因產(chǎn)生粉抑制劑可以抑制昆蟲消化中的淀粉酶活使害蟲不能消化所攝取的淀粉從而阻斷害蟲的能量來源。植物凝集素基因控制植物合成一種糖蛋白這種糖蛋白可與昆蟲腸道黏膜上的某種物質(zhì)結(jié)合從而影響害蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。病轉(zhuǎn)因植物植物像人一樣也會生病。引起植物生病的微生物稱原微物，主要病、真菌細菌等?？共∞D(zhuǎn)基因植物所采用的基因，使用最多的是病毒外殼蛋白基因病毒的復制酶基因；抗真菌轉(zhuǎn)基因植物中可使用的基因丁質(zhì)基因抗素成基因。由于鹽堿和干旱對農(nóng)作物的危害與細胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)有關目前科學家們正在利用一些可以調(diào)節(jié)細胞滲透壓的基因來提高農(nóng)作物鹽堿干旱能這在煙草等植物中已獲得了比較明顯的成果科學家將魚凍蛋白基因?qū)霟熀头咽篃煵莺头训哪秃芰刑岣叽送獬莼驅(qū)舜蠖褂衩椎茸魑飮姙⒊輨r殺死田間雜草而不損傷農(nóng)作物。用轉(zhuǎn)因改良物的質(zhì)許多食品含有的營養(yǎng)成分并不平衡例如豆類食品中含有蛋氨酸比較少大米玉米小麥則含賴氨酸比較少這些人體必需的氨基酸缺少后對人的健康不利?？茖W家將必需氨基酸含量多的蛋白質(zhì)編碼基因，導入植物中，或者改變這些氨基酸合成途徑中某種關鍵酶的活性，以提高氨基酸的含量。番茄含有豐富的維生素但不耐儲存我國科學家將控制番茄果實成熟的基因?qū)敕勋@得轉(zhuǎn)基因延熟番茄我科學家還成功地將與植青代謝有關的基因?qū)牖ɑ苤参锇珷颗＾D(zhuǎn)基因矮牽牛呈現(xiàn)出自然界沒有的顏色變異大大提高了花卉的觀賞價值。二動物工前景闊于提動物生速度由于外源生長激素基因的表達可以使轉(zhuǎn)基因動物生長得更快因此科學家們將這類基因?qū)雱游矬w內(nèi)以提高動物的生長速率。于改畜產(chǎn)品品質(zhì)例如，有些人食用牛奶后，對牛奶中的乳糖不能完全消化；也有些人食用牛奶后會出過敏、腹瀉、惡心等不適癥狀。為了解決這一問題科學家乳糖酶基因?qū)肽膛；蚴公@得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大減低而其他營養(yǎng)成分不受影響。轉(zhuǎn)基動物生藥物最令人興奮的是利用基因工程技術(shù)，還可以使哺乳動物本身變成“批量生產(chǎn)藥物的工廠。科學家用白基因乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起，通顯微注射等方法，導入哺乳動物受精卵中，然后，將受精卵送入母體內(nèi)使其生長發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物進入泌乳期后可以通過分泌的乳汁來生產(chǎn)所需要的藥品因而稱腺物應器房生物應器。轉(zhuǎn)基動物作官移的體豬的內(nèi)臟構(gòu)造大小血管分布與人極為相似而且豬體內(nèi)隱藏的可導致人類疾病的病毒要遠遠少于靈長類動物是否可以用豬的器官來解決人類器官的來源問題呢？實現(xiàn)這一目標的最大難題疫排斥目前科學家正試圖利用基因工程方法對豬的器官進行改造采用的方法是將器官供體基因組導入某種調(diào)節(jié)因子以抑抗決定基因的表達或設法抗原決定基因，再結(jié)合克隆技術(shù)，培育出沒有免疫排斥反應的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。5、基因工程藥物異軍突起工程菌：通過基因工程的方，使外源基因得到高效率表達的菌類細胞株系一般稱為“工程菌。干擾素是動物或人體細胞受到病毒侵染后產(chǎn)生的一種糖蛋白由于干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染因此它是一種抗病毒的特效藥。6、基因治療曙光初照基因治療是把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能從而達到治療疾病的目的這是治療遺傳病的最有效的手段復合型免疫缺陷癥是一種遺傳疾病一名患有嚴重復合型免疫缺陷癥的女童由于腺苷酸脫氨酶基因缺失造成體內(nèi)缺乏腺苷酸脫氨酶而腺苷酸脫氨酶是人體免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常功能作用所必需的因此女童不能抵抗病原微生物的威脅研究人員將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入取自患者的淋巴細中使淋巴細胞能夠產(chǎn)生腺苷酸脫氨酶然后再將這種淋巴細胞轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)半年后在血液中檢測出了被改造的淋巴細胞女童體內(nèi)產(chǎn)生的腺苷酸脫氨酶也越來越多女童產(chǎn)生抗體的能力顯著改善。大部分基因治療的臨床試驗都是先從病人體內(nèi)獲得某種細胞例如T淋巴細胞進行養(yǎng)然后在體外完成基因轉(zhuǎn)移再篩選成功轉(zhuǎn)移的細胞擴增培養(yǎng)最后重新輸入患者體內(nèi)上述方法雖然操作復雜但效果較為可靠稱為體外基因治療同時科學家們又千方百計設計出更加簡便的基因治療方法直接向人體組織細胞中轉(zhuǎn)移基因的治病方法叫做體內(nèi)基因治療。值得提出的是，無論一種基因治療，目前都處于初期的臨床試驗階段。用于基因治療的基因有三類第一類是從健康人體上分離得到的功能正常的基因用以代病變基因或依靠其表達產(chǎn)物來彌補病變基因帶來的生理缺陷第二類是反義基因即通過產(chǎn)生的mRNA與病變因產(chǎn)生的mNA進行互補來非正常蛋白質(zhì)的合成。第三是編碼可以殺死癌變細胞的蛋白酶基因，又叫做自殺基因7、神奇的基因芯片基因芯片又叫做DA芯片，核苷酸芯片，或DA微陣列通過微加工技術(shù)將數(shù)以萬計乃至百萬計的特定序列的DA片（基因探針有規(guī)律排列固定于2m2的硅片玻片等支持物上構(gòu)成的一個二維DA探針陣列與計算機電子芯片十分相似所以被稱為基因芯片基因芯片主要用于基因檢測工作。科學家讓芯片成千上萬的探針分子，與被測的帶有標記的基因樣品，按堿基互補配對原理進行雜交然后通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描再利用計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號進行比較和檢測從而迅速得出需要的信息。1 蛋白質(zhì)工程的崛起一、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)這些天然蛋白質(zhì)是生物在長期進化過程中形成的它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要例如干擾素動物體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)可以用于治療病毒的感染和癌癥，但體外保存相當困難。如果將其分子上的一個半胱氨酸變成絲氨酸，那么在-70℃的條件下可以保存半年。二、蛋白質(zhì)工程的基本原理蛋白質(zhì)工程的目標是根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行分子設計由于基因決定蛋白質(zhì)，因此，要對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行設計改造，最終還必須通過基因來成。天然蛋白質(zhì)合成的過程是按照中心法則進行的：基因→表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯）→形成氨基酸序列的多肽鏈→形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)行生物功能而蛋白質(zhì)工程卻與之相反它的基本途徑是從預期的蛋白質(zhì)功能出→計預期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應的氨基酸序列→找到相對的脫氧核苷酸序列（基因三、蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程：是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造制造一種新的蛋白質(zhì)以滿足人類生產(chǎn)和生的需求也就是說蛋白質(zhì)程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，是包多學科的綜合科技工程領域。四、蛋白質(zhì)工程的進展和前景蛋白質(zhì)工程是一項難度很大的工程目前成功的例子不多主要是因為蛋白質(zhì)發(fā)揮功能必須依賴于正確的高級結(jié)構(gòu)這種高級結(jié)構(gòu)十分復雜而目前科學家對蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)了解還很不夠要設計出更加符合人類需要的蛋白質(zhì)還需經(jīng)過艱辛的探索。我們相信，隨著科學技術(shù)的深入發(fā)展，蛋白質(zhì)工程將會給人類帶來更多的福音。思考:1.你知道人類蛋白質(zhì)組計劃嗎？它與蛋白質(zhì)工程有什么關系？我國科學家承擔了什么任務？提示：人類蛋白質(zhì)組計劃是繼人類基因組計劃之后，生命科學乃至自然科學領域一項重大的科學命題。201年，國際人類蛋白質(zhì)組組織宣告成立之后該組織正式提出啟動了兩項重大國際合作行動一項是由中國科學家牽頭執(zhí)行的“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”另一項以美國科學家牽頭執(zhí)行的“人類血漿蛋白質(zhì)組計劃”由此拉開了人類蛋白質(zhì)組計劃的帷幕。2.對天然蛋白質(zhì)進行改造，認為應該直接對蛋白質(zhì)分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？答毫無疑問應該從對基因的操作來實現(xiàn)對天然蛋白質(zhì)改造主要原因如下①任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質(zhì)進行了改造而且改造過的基因可以遺傳下去如果對蛋白質(zhì)直改造即使改造成功被改造過的蛋白質(zhì)分子是無法遺傳的。對基因進行改造比對蛋白質(zhì)直接改造要容易操作，難度要小得多。2.1.1 植物細胞工程的基本技術(shù)植物的花瓣屬度分的組利用它來培育出新的植株首先要通過細胞脫分過程培養(yǎng)傷組后再從愈傷組織分化形成小植株這里所說的細胞脫分化就是讓已經(jīng)分化的細胞經(jīng)過誘導后失去其特有功轉(zhuǎn)變分細胞的過程在植一些分化的細胞經(jīng)激的誘導可以脫分化為具分生能力的薄壁細進而形成植物的愈傷組織。愈傷組織在一定的培養(yǎng)條件下，又可分出幼根和芽，形成完整的植株。為什么植物的一瓣花瓣就可以培育出完整的植株呢？我們知道具種物全遺傳信的任何一個細胞，都具有發(fā)育成完整生物體就是每個生物細胞都具有全能性的特點因此在理論上生物的任何一個細胞都具有發(fā)育成完整植株的潛力但是在生物的生長發(fā)育過程中細胞并不會表現(xiàn)出全能性而是分化成各種組織和器官這是因為在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會有選擇性地表達出各種蛋白質(zhì)，從而構(gòu)成生物體的不同組織和器官。植物組織培養(yǎng)技術(shù)實驗：胡蘿卜的組織培養(yǎng)實驗原理：植物體的根、莖、葉細胞一般都具有全能性，在一定的營養(yǎng)和激素等條件下，可以脫分化形成愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同激素成分的培養(yǎng)基上就可以誘導其再分化生成胚狀體或叢芽進而發(fā)育成完整的小植株植物組織培養(yǎng)的全過程，證明了分化的植物細胞，仍具有形成完整植株所需要的全部基因方法步驟1.將胡蘿卜根用自來水充分凈，削去外皮，并切成段（約10m)。用酒精棉球擦手消毒。2.在超凈工作臺（或接種箱上將胡蘿卜段用酒精溶液毒30s后，立即用無菌水清洗2—3次再用次氯酸鈉溶液處理3in后，立即用無水清洗23次3.無菌的濾紙吸去胡蘿卜表面的水分。然后，在消毒瓷磚上，用無菌的解剖刀將胡蘿卜段切成1cm厚的橫切片，再選取有形成層的部位，切取1m3左右的小塊4.將胡蘿卜組織塊接種到培基上用錫箔紙封蓋瓶口并橡皮筋扎緊然后在培養(yǎng)瓶貼上標簽寫明材料名稱、接種日期和小組編號。5.將接種后的胡蘿卜組織塊放在2~6℃恒溫避光條件培養(yǎng)4d檢查培養(yǎng)材料污染情況1d后觀察愈傷組織的生長狀況。然后，在恒溫箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，注意定期觀察和記錄愈傷組織的生長情況。6.培養(yǎng)一段時間后，將生長好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培基上，培養(yǎng)一段時間后，胡蘿卜的愈傷組織就可以誘導出試管苗。然后將試管苗移栽到大田，培養(yǎng)成正常植株。討論1.在組織培養(yǎng)實驗中，為什要強調(diào)所用器械的滅菌和實驗人員的無菌操作？提示：植物組織培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)成分，有利于培養(yǎng)物的生長，然而各種雜菌同樣也可以在上面迅速生長，所以植物組織培養(yǎng)過程中污染現(xiàn)象經(jīng)常生。培養(yǎng)基一旦被污染，迅速生長的各種雜菌不但會和培養(yǎng)物爭奪營養(yǎng)，而且這些雜菌生長的過程中會生成大量對培養(yǎng)物有害的物質(zhì)，導致養(yǎng)物迅速死亡。造成培養(yǎng)基污染的因素有很多，一般包括：外植體帶菌、培養(yǎng)瓶和各種器械滅菌不徹底、操作人員操作不規(guī)范等。所以在組織培養(yǎng)實驗中用到的各種器械都要進行徹底地滅菌，實驗人員操作一定規(guī)范，避免帶入雜菌。2.在本實驗中，切取胡蘿卜根時強調(diào)要切取含有形成層部分，原因是這部分容易誘導形成愈傷組織請思考一下胡蘿卜的其他部（如莖、葉、花），是否也能培養(yǎng)成小植株？提示：能，只是誘導愈傷組織比較困難3.請根據(jù)上面的實驗過程，括出植物組織培養(yǎng)技術(shù)的流程簡圖。培養(yǎng)基的組成：固體培養(yǎng)基大多數(shù)都是由無機營養(yǎng)成分有機營養(yǎng)成分、激素瓊脂四分組成。通過上面的實驗我們可以總結(jié)出植物組織培養(yǎng)就是在無菌和人工控制條件下將離體的植物器官組織細胞培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形完整的植株。植物體細胞雜交技術(shù)科學家嘗試將番茄和馬鈴薯雜交試圖培育出一種地上長番茄地下結(jié)馬鈴薯的“超級作物”但是不同的兩種生物之間存在著天然的生殖隔離用傳統(tǒng)的有性雜交方法不可能得到二者的雜種后代經(jīng)過長期的實驗科學家們采用體細胞雜交的方法，終于得到了“番茄—馬鈴薯”雜種植株。在進行體細胞雜交之前必須先利用纖維素酶和果膠酶去這層細胞壁獲得具有活力的原生質(zhì)體雜交過程中的另一個關鍵環(huán)節(jié)是原生質(zhì)體間的融合進行原生質(zhì)體間的融合必須要借助一定的技術(shù)手段進行人工誘導人工誘導的方基本可以分為兩大類—物理法和化學法。物理法包括離心振動、電激等；化學法一般是聚乙二醇（E)作為誘導劑誘導細胞融合。植物體細胞雜交就是將不同種的植物體細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種胞培育成新的植物體的技術(shù)雖然科學家們歷盡艱辛終于實現(xiàn)了兩個物種間的雜交可惜這株同時具有兩個物種遺傳物質(zhì)的超級植物并沒有如科學家所想像的那樣，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯。盡管如，這項研究還是在克服不同生物遠緣雜交的障礙上，取得巨大的突破。思考與探究1.為什么“番茄—馬鈴薯”級雜種植株沒有如科學家所想像的那樣，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯？提示：生物基因的表達不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控相互影響的，所以馬鈴薯—番茄交植株的細胞中雖然具備兩個物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達受到相互干擾，不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達，雜交植株不能地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯就是很自然的了。2.自然界中有一種含有葉綠的原生動物──眼蟲，說明植物的細胞器同樣可以在某些動物細胞中存活，請?zhí)接懀簞游锛毎c植物細胞之間可以實現(xiàn)雜交嗎？如果理論上可行，請設計出具體實驗方案。提示：根據(jù)眼蟲的特點，動物細胞和植物細胞之間在理論上是可以實現(xiàn)雜交的。具體的實驗方案可以設計如下：10PAGEPAGE11第2節(jié) 植物細胞工程的實際應用一、植物繁殖的新途徑1、微型繁殖植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以保持優(yōu)良品種的遺傳特性還可以高效快速地實現(xiàn)種苗的大量繁殖因此人們形象地把用于快速繁殖優(yōu)良品種的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，叫做植物的微型繁殖技術(shù)，也叫快速繁殖技術(shù)2、作物脫毒馬鈴薯和草莓都是無性繁殖作物它們感染的病毒很容傳播給后代病毒在作物體內(nèi)逐年積累就會導致作物產(chǎn)量降低品質(zhì)變差科學家們發(fā)現(xiàn)植生區(qū)附（如莖的病毒極少甚至無病毒因此切取一定大小的莖尖進組織培養(yǎng)，再生的植株就有可能帶病毒，從而獲毒苗。奇的工種子農(nóng)業(yè)林業(yè)生產(chǎn)離不開種子但不少樹木需要生長數(shù)年后才能結(jié)出種子一些作物優(yōu)良雜種的后代也會因發(fā)狀分離而喪失其優(yōu)良特性。另外，常規(guī)種子的生產(chǎn)還會受到季節(jié)、氣候和地域的限制，并且需要占用大量的土地來實現(xiàn)制種。人工種子：就是以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經(jīng)過人工薄膜包裝得到的種子。人工種子在適宜條件下同樣能夠萌發(fā)長成幼苗。狀體是指在組織培養(yǎng)過在植物組織塊或愈傷組織上產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)它與正常受精卵發(fā)育形成的胚有類似的結(jié)構(gòu)和發(fā)育過程其不同的發(fā)育階段也可以用正常胚發(fā)育中各個時期的術(shù)語來描述如原胚球形胚心形胚魚雷形胚等。思考1、為了促進胚狀體的長發(fā)育，還可以向人工種皮中加入哪些物質(zhì)？分析：可以加入適量的養(yǎng)分、無機鹽、有機碳源以及農(nóng)藥、抗生素、有益菌等。為了促進胚狀體的生長發(fā)育，還可以向人工種皮中加入一些植物生長調(diào)節(jié)劑。二作物品種培育倍體育：常規(guī)選育出一可以穩(wěn)定遺傳的農(nóng)作物優(yōu)良品種，一般要經(jīng)過5—6年的連續(xù)篩選。而單倍體育種則是通過花藥培養(yǎng)獲單倍體植株染色體加倍后當年便可得穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良品種，這樣就極大地縮短了育種時間，節(jié)約了大量的人力物力。單倍體育種已成為作物育種的一條新途徑變體的在植物的組織培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)細胞一直處于不斷分生狀因容易受到培養(yǎng)條件和外界壓力（如射線化學物質(zhì)等的影響而產(chǎn)突變從這些產(chǎn)生突的個體中可以篩選出對人們有用的突變進而培育成新品種體細胞誘變育種：在作物育種中，可以對植物的愈傷組織進行化學或物理的誘變處理，促使其發(fā)生突變，再通過誘導分化形成植株。從這些植株中篩選出高抗、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的突變體，就可以培育成新品種。三細胞物的廠化產(chǎn)組織培養(yǎng)技術(shù)除了在農(nóng)業(yè)上的應用外還廣泛應用于另一個重要的領域即細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)這些細胞產(chǎn)物包括蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、藥物、香料、生物堿等。野拓展：植物生長調(diào)節(jié)劑組織培養(yǎng)中的神奇作用培養(yǎng)基中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑一般可以分為生長素類細胞分裂素類和赤霉素類此外脫(B)和多效唑(P33)也可以用于植物的組織培養(yǎng)。生長素類在組織培養(yǎng)中長素用于誘導細胞分裂的分化常用的生長素有A（吲哚乙酸B（吲哚3-丁酸）、NAA（萘乙酸和24—D(24—二氯苯氧乙酸)其中IA和NA廣泛用于誘分化生長物生根，并能與胞分裂素互相作而促進莖的增殖2-D常用于植物愈傷織的誘導和生長但它趨向于抑制植物形態(tài)的發(fā)生所以在分化培養(yǎng)基中很少利用。細胞分裂素類在培養(yǎng)基中細胞分裂素的王要作用是促進組織細胞分裂或從愈傷組織器官上分化定芽比較常用的細胞分裂素有6BA（芐基腺嘌呤）、KT（激動素呋喃氨基嘌呤）和玉米素。其中6BA一般用于誘導植物的傷組織分化出叢芽，而KT的作主要是刺激培養(yǎng)物的細胞加速分裂，加快培養(yǎng)物的生長速度。赤霉素類赤霉素類植物生長調(diào)節(jié)劑的主要作用是刺激培養(yǎng)細胞伸所以在組織培中一般使用赤霉素來刺激分化的叢芽或小植株快長高。霉素在高溫下極降解，一是過濾除菌后再加入到已溫滅菌的培養(yǎng)基中。生長素與細胞分裂素的協(xié)同調(diào)控作用在組織培養(yǎng)中非常重要人們常把它們稱為“激素杠桿”例如當生長素與細胞分裂素的比例適中且生長素含量高于細胞分裂素時主要誘導植物組織脫分化根原基的形成而當細胞分裂素的效應高于生長素時則主要誘導植物組織再分化芽原基的形成另外植物生長調(diào)節(jié)劑在培養(yǎng)基中的用量要考慮組織內(nèi)源素的含量。2.2動物細胞工程動物細胞工程常用的技術(shù)手段有動物細胞培養(yǎng)動物細胞核移植動物細胞融合生產(chǎn)單克隆抗體等其中動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細胞工程術(shù)的基礎。2.2.1動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關的組織將它分散個細胞然后放在適的培養(yǎng)基讓這些細生長增殖。物細胞養(yǎng)的程成塊的組織中細胞與細胞靠在一起彼此限制了細胞生增殖因此進行細胞培首先將組織分散成許多單個細胞方法是從健康動物體內(nèi)取出組織塊剪碎白酶膠原白酶處理一段時這樣組織就會分散成單個細胞。然后用培養(yǎng)液將分散的細胞稀釋制成細胞懸液再將細胞懸液放入培養(yǎng)瓶內(nèi)置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)懸液中分散的細很快就貼附在瓶壁上稱胞培養(yǎng)貼附性細胞時胞要能夠貼附于底物上才生增殖這就要求培養(yǎng)瓶或養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑無毒易于貼附以后細胞進行有絲分裂數(shù)量不斷增多當貼壁細胞分裂生長到面相接觸時細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞觸抑制。人們常物組消化后初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。滿瓶壁的細胞需要重新用蛋白酶等處然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)讓細胞繼續(xù)增殖這樣的培養(yǎng)過程通常被稱代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代后就不易傳下去了。一來說，細胞在傳至1~0代右時，增殖會逐漸緩慢，以至于完全停止這時部分細胞核型可能會發(fā)生變化當續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細胞會克服細胞壽命的自然極限獲得不死性這些細胞已經(jīng)發(fā)生突變正在朝著等同于癌細胞的方向發(fā)展目前使用的或冷凍保存的正常細胞通常為10代內(nèi)，以保持細胞正常倍體。根問底：胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎？提示胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白外長時間的作用也會消胞膜蛋白對胞有損傷作因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。思考：進行動物細胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？提示：用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。多數(shù)動物細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2～7.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高。小知識：1957年，科學家采用胰蛋白酶消化處理和應用液體培養(yǎng)基的方法，獲得單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對細胞培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動作用。此后單層細胞培養(yǎng)成為細胞培養(yǎng)普遍應用的技術(shù)。動物細胞培養(yǎng)的條件無菌、無毒的環(huán)境：首先應保證被培養(yǎng)的細胞處于無菌、無毒的環(huán)境，即對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理。通常還要在細胞培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素以防培養(yǎng)過程中的污染此外應定期更換培養(yǎng)液以便清除代謝產(chǎn)物防止細胞代謝產(chǎn)物積累對細胞自身造成危害。營養(yǎng)：細胞體外培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)基本相同，例如，需要有糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。將細胞所需的上述營養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴格配制而成的培養(yǎng)基，稱為合成培養(yǎng)基。由于人們對細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，因此，在使用合成培養(yǎng)基時，通常需加入血清、血漿等一些天然成分。溫度和pH：細胞體外培養(yǎng)的適宜溫度一般與動物的體溫相近，哺乳動物多以36.5±0.5℃為宜。多數(shù)細胞生存的適宜pH為7.2~7.4。氣體環(huán)境：細胞培養(yǎng)所需氣體主要有O2和CO2，O2是細胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。進行細胞培養(yǎng)時，通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶，將其置于含95%空氣加5%CO2的混合氣體的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。小知識：在科學研究中，有需要明確界定培養(yǎng)液的成分，而血清中由于含有許多未知成分，會對研究結(jié)果有所影響，因此在進行細胞培養(yǎng)時也可采用無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中添加一些已知的促進細胞生長和增殖的物質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)扶術(shù)的應用許多有重要價值的生物制品如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等，都可以借助動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)。動物細胞是基因工程技術(shù)中常用的受體細胞，因此，基因程也離不開動物細胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)的動物細胞還可以用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性科學家培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變的細胞用于生理病理藥理等方面的研究如用于篩選抗癌藥物等為治療和預防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)。動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物高度分化的植物組織仍保持著全能性但動物細胞與植物細胞不同動物細胞的全能性會隨著動物細胞分化程度的提高而逐漸受到限制分化潛能逐漸變?nèi)跻虼四壳斑€不能用類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動物個體用動物體細胞克隆的動物，實際是通過核移植來實現(xiàn)的。動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物哺乳動物核移植可以分為胚胎細胞核移植和體細胞核移植。由于動物胚胎細胞分化程度低，恢復其全能性相對容易，而動物體細胞分化程度高，復其全能性十分困難，因此，動物體細胞核移植的難度也就明顯高于胚胎細胞核移植體細胞核移植的過程下面以克隆高產(chǎn)奶牛為例，來說明體細胞核移植的大致過程。①從供體高產(chǎn)奶牛身體的某部位取體細胞，培養(yǎng)供體細胞（動物細胞培養(yǎng)；②從卵巢中采集卵母細胞，培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期；③通過顯微操作去除卵母細的核由于MI期卵母細胞核的位置靠近第一極體用微型吸管可一并吸出細胞核與第一極體④將供體細胞注入到卵母細胞外的透明帶位置；⑤通過電刺激供體細胞膜卵母細胞膜融合，供體核進受體卵母細胞，構(gòu)建重組胚胎；⑥用物理（如電脈沖）或化方法（如鈣離子載體）激活受體細胞，使其完成分裂發(fā)育進程。⑦早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植。討論：1.在體細胞的細胞核移植到體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？提示：為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細。2.用于核移植的供體細胞一都選用傳代10代以內(nèi)的細胞想一想，這是為什么？提示：0代以內(nèi)的細胞一能保持正常的二倍體核型3.你認為用上述體細胞核移方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了10%的制嗎？為什么？提示克隆動物絕大部分NA來自于供體細胞核但其核還有少量的DA線粒體的DA是來自于受體卵母細胞所以，用教材中所述的方法克隆的動物不是供核動物完全相同的復制。此外即便動物的遺傳基礎完全相同但動物的一些行為習性的形成與所處環(huán)境有很關系核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境不會完全相同其形成的行為習性也不可能和核供體動物完全相同從這一角度看克隆動物不會是核供體動物10%的復制生物技術(shù)資料卡：目前核移植技術(shù)中普遍使用的去核方法是顯微操作去核法。還有人采用其他方法，如梯度離心、紫外光短時間照射化學物質(zhì)理等這些方法是在沒有刺破透明帶或卵母細胞質(zhì)膜的情況下去除細胞核或使卵細胞核DNA變性，從而達去核的目的拓展視野：核移植技術(shù)發(fā)展簡史早在1938年就有人提出核移技術(shù)，但將它作為研究細胞分化的一種方法，卻僅限于兩棲類動物。早期的試驗結(jié)果顯示，受精卵最初幾次分裂的細胞具有全能性；當胚胎進一步分化時，細胞就喪失了全能性，這時如果去掉胚胎的部分細胞，胚胎就不能發(fā)育為一個完整的個體。PAGEPAGE14192年，美國學者布里格斯金將豹蛙囊胚細胞的核移植到去核卵中，得到了能夠發(fā)育的胚胎。他們改進了核移植技術(shù)后在正常分裂的卵中有8%可以發(fā)育成幼蛙這些研究結(jié)果表明細胞的全能性雖然隨著細胞分化程度的提高而逐受到限制，但細胞核仍含有保持該物種遺傳性的全部基因，就是說高度分化細胞的細胞核仍保持有全能性。20世紀0年代我國科學運用核移植技術(shù)將鯉魚囊胚細胞的細胞核移植到已去核的鯽魚未受精卵中培養(yǎng)出鯉鯽移核魚，這樣的魚兼有鯽魚和鯉魚的特點并且具有正常的生殖能力。20世紀0年代哺乳動物的移植研究有了很大的進展11年瑞士學者伊爾曼斯和霍將小鼠胚胎的細胞核注入去核的受精卵中獲得了胚胎細胞核移植的小鼠以后人們用體內(nèi)或體外成熟的卵母細胞代替了受精卵作為受體細相繼得到了胚胎細胞核移植的各種動物，如綿羊、牛、小鼠、兔、豬等。但體細胞核移技術(shù)一直未能成功。直到1997年國學者韋爾穆特等宣布用成年綿羊乳腺細胞得到體細胞核移后代才獲得了突破性的進展這就是轟動世界的綿羊多利多利的誕生說明成年動物的體細胞核移植技術(shù)獲得了成功在以后的幾年中各種體細胞克隆動物如小鼠牛山羊豬以及各種轉(zhuǎn)基因克隆動物也相繼問世。2.2.2 動物細胞融合與單克隆抗體物細胞合動物細胞融合也胞雜交是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息單核細胞，稱雜交細胞。動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同誘導動物細胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法也類似常用的誘導因素有聚乙二醇(PG)活的病毒、電激等。細胞融合技術(shù)突破了有性雜交方法的局限緣雜交成可至今種間屬間科間甚至動物和植物之間的細胞融合都已獲得了成功。利用細胞融合技術(shù)而發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制克隆體辟了新途徑。物技術(shù)料滅活病毒誘細胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用使細胞互相凝聚細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分新排細胞膜打開細胞發(fā)生融合滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失感染能力，但并不破壞這些病原體抗原構(gòu)克隆抗體長期以來人們?yōu)榱双@得抗體采用的方法是向動物體內(nèi)反復注種抗原使動物產(chǎn)抗然后從動血清中分離所需抗體。這種方法不產(chǎn)低、純低，而且制備的異性差。動物在免疫反應的過程中體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上但是每一個B淋巴細胞只分種特性抗體。因此，要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細胞，形成細胞群。遺憾的是，在體外培養(yǎng)條件下，一個B淋巴細胞是不可能無限增殖的，怎樣解決這一問題呢？克隆抗的制備用羊的紅細胞對小鼠進行注射使小鼠產(chǎn)生免疫反應從產(chǎn)生免疫反應小鼠脾臟細胞他們得到羊紅細胞的抗體，這說明在小鼠的脾細胞中形成了相應的B淋巴細胞。們又設法將鼠髓瘤細胞脾細胞中產(chǎn)生的B淋巴細胞合，再用特定選擇性培養(yǎng)基進行篩選。在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜種細胞才能生長。這種雜種細胞的特點是既速大繁殖，又生專的抗體。上述經(jīng)選擇性培養(yǎng)的雜交瘤細胞，還需進隆化養(yǎng)抗體檢測經(jīng)多次篩選就可獲得夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細最后將雜交瘤細胞在體外條件下做大規(guī)模培養(yǎng)，或注射鼠腹腔內(nèi)增殖，這樣，細培養(yǎng)液小鼠腹水中，就以提取出大量的單克隆抗體了。單克隆抗體的應用單克隆杭體最主要的優(yōu)點在于它的特異性強、靈敏度高，并可能大量制備①作為診斷試劑由于單克隆抗體純度高特異性強所以能準確地識別各種抗原物質(zhì)的細微差并跟定抗原發(fā)生特異性結(jié)合因此，單克隆抗體在診斷的應用上，具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。例如，在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素(HG)，在孕婦的尿中大量存在，而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有“早早孕診斷試劑盒靈敏度很高在妊娠的第８天就可以做出診斷其起核心作用的物質(zhì)是抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體。②用于疾病檢測甲胎蛋白（AFP）是一種特異較強的腫瘤標志物，用甲胎蛋白作為抗原免疫小鼠，制抗AFP單克隆抗體，并與含有放射性同位素的標記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標記物通過血液可到達全身幾乎所有組織。由于腫瘤細胞表面的AFP會和單克隆抗體特異性的結(jié)合，所以放射性同位素標記物就不斷積累在腫瘤上。通過一的顯影技術(shù)就可以發(fā)現(xiàn)腫瘤所在③用于治療疾病和運載藥物如果把抗癌細胞的單克隆抗體跟放射性同位素、化學藥物或細胞毒素相結(jié)合，制成“生物導彈，注入體內(nèi)，借助單克隆抗體的導向作用，能將藥定向帶到癌細胞所在位置，在原位殺死癌細胞。專題3胚胎工程胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操和處理技術(shù)如體外受精胚胎移植胚胎分割胚胎干細胞培養(yǎng)等技術(shù)。經(jīng)過處理后獲得的胚胎，還需移植到雌性動物體內(nèi)生產(chǎn)后代，以滿足人類的各種需求。180年，英國劍橋大學的生學家將純種安哥拉兔的兩個4細胞胚胎移入一只純種比利時兔的輸卵管內(nèi)，成功地產(chǎn)下兩只純種安哥拉子兔。這個實驗首次證實同種動物的胚胎在異體動物體內(nèi)發(fā)育的可能性精子的發(fā)生

3.1 體內(nèi)受精和早期胚胎發(fā)育哺乳動物精子的發(fā)生是在睪丸內(nèi)完成的雄性動物從初情（相當于人的青春期開始直到生殖機能衰退在睪丸的曲細精管內(nèi)不斷進行著生殖胞的增殖，源源不斷地產(chǎn)生精子。各種家畜精子發(fā)生的過程大體可以分為三個階段。第一階段位于曲細精管管壁的精原細胞進行數(shù)次有絲分裂產(chǎn)生大量的精原細胞其中部分精原細胞經(jīng)過染色體復制和其他物質(zhì)的合成，進一步形成初級精母細胞。第二階段初級精母細胞連續(xù)進行兩次分（即減數(shù)分裂包括MⅠ和MⅡ第一次分產(chǎn)生兩個次級精母細胞每個次級精母細胞再分裂一次產(chǎn)生兩個含單倍染色體的精子細胞。第三階段，圓形的精子細胞經(jīng)過變形，其中的細胞核變?yōu)榫宇^的主要部分，高爾基體發(fā)育為頭部的頂體，中心體演變?yōu)榫拥奈簿€粒體聚集尾的基部形成線粒體鞘同細胞內(nèi)的其他物質(zhì)濃縮為球狀叫做原生質(zhì)滴隨精子成熟過程向后移動，直到最后脫落。對于多數(shù)家畜來說，精子在睪丸內(nèi)形成的時間為兩個月左右。卵子的發(fā)生卵子的發(fā)生是在雌性動物的卵巢內(nèi)完成的動物的胚胎在性別分化以后雌性胎兒卵巢的卵原細胞就通過有絲分裂的方式不斷增加其數(shù)量并進一步演變?yōu)槌跫壜涯讣毎@時它被卵泡細胞包圍形卵泡初級卵母細胞需經(jīng)過數(shù)分裂才能變?yōu)槌墒斓穆炎訙p數(shù)第一次分裂是在雌性動物排卵前后完成的其結(jié)果產(chǎn)生一次級卵母細胞和第一極體進入輸卵管準備與精子受精減第二次分裂是在精子和卵子結(jié)合的過程中完成的次級卵細胞經(jīng)分裂產(chǎn)生一個成熟的卵子和第二極體。當在卵細胞膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體時，說明卵子已經(jīng)完成了受精，這是判斷卵子是否受精的重要標志。哺乳動物卵泡的形成和在卵巢內(nèi)的儲備，是在出生前（即胎兒時期）完成的，這是精子卵子在發(fā)生上的重要區(qū)別。1.一個卵泡中能形成幾個成的卵子？答：正常情況下，一個卵泡只能形成一個成熟的子。2.排卵是指卵子從卵泡中排，還是指卵泡從卵巢中排出？答：是指卵子從卵泡中排出。3.剛排出的卵是成熟的卵子？它在母體的什么部位與精子受精？答：剛排出的卵子尚未完全成熟，僅完成第一次減數(shù)分裂，需要在輸卵管內(nèi)進一步成熟，直到第二次減數(shù)分裂的中期才能與精子結(jié)合完成受精過程。排出的卵子是在輸卵管內(nèi)與精子受精的。受精受精是精子與卵子結(jié)合形成合（即受精卵的過程它包括受精前的準備階段和受精階段在自然條件下受精是在雌性的輸卵管內(nèi)完成的準備階段1—精子獲能剛剛排出的精子不能立即與卵子受精必須在雌性動物生殖道發(fā)生相應的生理變化才能獲得受精能力11年，張明覺和奧斯汀發(fā)現(xiàn)了這一生理現(xiàn)象，并把它稱為“精子獲能。這一發(fā)現(xiàn)加速了科學家精子獲能機理的研究，并且找到了使精子在體外獲能的物質(zhì)，實現(xiàn)了各種哺乳動物精子在體外條件下的獲能。準備階段2—卵子的準備卵子一般在排出后2一h才被精子穿入。一些實驗證據(jù)表明，卵子在受精前也要經(jīng)歷類似精子獲能的過程。動物排出的卵子成熟程度不同有的可能是初級卵母細胞如馬犬等有的可能是次級卵母胞如豬羊等但它們都在輸卵管內(nèi)進一步成熟，當達到減數(shù)第二次分裂的中期時，才備與精子受精的能力。受精階段哺乳動物的受精過程主要包括：精子穿越放射冠和透明帶進入卵細胞膜原核形成和融合獲能后的精子與卵子相遇時首先發(fā)生頂體反應使頂體的酶釋放出來放射冠是包圍在卵子透明帶外而的卵丘細胞群，精子所釋放的頂體酶可直接溶解卵丘細胞之間的物質(zhì)，形成精子穿越放射冠的通路。穿過放射冠的精子立即與透明帶接觸頂體酶隨后將透明帶溶出一條孔道精子借自身運動穿越透明帶并接觸卵細胞膜在精子觸及卵細胞膜的瞬間會產(chǎn)生阻止后來的精子進入透明帶的生理反應這個反應稱做透明帶反應它是防多個精子進入透明帶，引起多精子入卵受精的第一道屏障。只有穿過透明帶的精子才能與卵細胞膜接觸由于卵細胞膜表面有大量的微絨毛當精子與卵細胞膜接觸時立即被微絨毛抱合，隨后，精子外膜和卵細胞膜相互融合，精子入卵。精子入卵后卵細胞膜會立即發(fā)生一種生理反應拒絕其他精子再進人卵內(nèi)這種生理反應稱做卵細胞膜反應這是防止多精入卵受精的第二道屏障。精子入卵后的另一個變化是尾部脫離并且原有的核膜破裂隨后精子形成一個新的核膜最后形成一個比原來精子核還大的核，叫做雄原核。與此同時，精子入卵后被激活的卵子完成減數(shù)第二次分裂，排出第二極體后，形成雌原核，雌原核一般略小于雄原核。雄雌原核充分發(fā)育后相向移動彼此接觸二者體積縮小合并兩組核染色體合為一組形成一個含二倍染色體的合子，也就是受精卵。受精過程至此結(jié)束，受精卵的發(fā)育也由此開始。小知識：多數(shù)哺乳動物的第極體不進行減數(shù)第二次分裂形成兩個第二極體。胚胎發(fā)育合子形成后即在輸卵管內(nèi)進有絲分裂，開始發(fā)育胚胎發(fā)育的早期有一段時間是在透明帶內(nèi)進行的這一時稱為卵裂期其特點是細胞分裂方式為有絲分裂細胞的數(shù)量不斷增加，但胚胎的總體積并不增加，或略有縮小根據(jù)胚胎形態(tài)的變化，可將早期發(fā)育的胚胎分為以下幾個階段。桑椹胚：當胚胎細胞數(shù)目達到32個左右時，胚胎形成致密細胞團，形似桑椹，叫做桑椹胚。實驗證實，這一階段前的每一個細胞都具有發(fā)育成完整胚胎的潛能，屬于全能細。囊胚桑椹胚進一步發(fā)胞開始出現(xiàn)分化聚集在胚一端個體較大的細胞稱為內(nèi)細胞（ICM將來發(fā)育成胎兒的各種組織，而沿透明內(nèi)壁擴展和排列的、個體較小的細胞，稱為滋養(yǎng)層細胞，們將來發(fā)育成胎膜和胎盤隨著胚胎的進一步發(fā)育胚胎的內(nèi)部出現(xiàn)了含有液體的囊腔——囊胚腔，這個時期胚胎叫做囊胚。囊胚進一步擴大，會導致透明帶的破裂，胚胎從其中伸展出來，這一過程叫做孵化原腸胚：囊胚孵化后，進一步發(fā)育，內(nèi)細胞團表層的細胞形成外胚層，下方的細形成內(nèi)胚層。這時的胚胎稱原腸胚，由內(nèi)胚層包圍的囊腔叫做原腸腔。滋養(yǎng)層則發(fā)育為兒的胎膜和胎盤。3.2 體外受精和早期胚胎培養(yǎng)體外受精哺乳動物的體外受精主要包括卵母細胞的采集、精子的獲取和受精等幾個主要步驟。卵母細胞的采集和培養(yǎng)對于實驗動物如小鼠、，以及家畜豬、羊等，采用的主要方法是：用促性腺激素理，使其排出更多的卵子，后，從輸卵管中沖取卵子直接獲能的精子在體外受精。小知識超數(shù)排卵處理的做是給供體注射促性腺激素一頭母畜一次排出比自然清況下多幾倍到十幾倍的卵子用于體外受精和早期胚胎培養(yǎng)。對于大家畜或大型動物如牛采用的主要方法是從屠宰場已屠宰母畜的卵巢中采集卵母細胞也可以借助超聲波探測儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡等工具，直接從活體動物的卵巢中取卵母細胞。采集的卵母細胞，都要在體外經(jīng)人工培養(yǎng)成熟后，才能與獲能的精子受精。精子的采集和獲能收集精子的方法有假陰道法手握法電刺激法等假陰道法是采用仿生學的方模仿發(fā)情雌性動物陰道環(huán)境設計的裝置它能夠滿足雄性動物交配時對壓力溫度和潤滑度的要求同時配有與采精動物相適應的活臺畜或假臺畜使用假臺畜時要訓練被采精動物爬跨臺畜并將精液射入假陰道，以便收集。手握法不需要任何設備徒手或戴上乳膠手套直接把握雄性動物的陰莖給予適當?shù)膲毫痛碳ぞ涂梢鹕渚@種方法只適于豬和犬等體型較小，易于控制的家畜。電刺激法是將動物麻醉后用特制的電極伸入動物的直腸直接刺激位于腰薦部的射精中樞神經(jīng)引起射精這種方法多用于野生或經(jīng)濟動物。在體外受精前要對精子進行獲能處理通常采用的體外獲能方法有培養(yǎng)法化學誘導兩種對于嚙齒動物家兔和豬等動物的精子一般采用培養(yǎng)法即將取自附睪的精子放入人工配制的獲能液中養(yǎng)一段時間后精子就可獲能對于牛羊等家畜的精子常采用化學法即將精子放在一定濃度的肝素鈣離子載體A23187液中用化學藥物誘導精子獲能受精獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵子一般情況下都可以在獲能液或?qū)Ｓ玫氖芫芤褐型瓿删^程精子和卵子一般要放在培養(yǎng)胚胎的早期培養(yǎng)精子與卵子在體外受精后應將受精卵移入發(fā)育培養(yǎng)液中續(xù)培養(yǎng)以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育能力哺乳動物胚胎的培養(yǎng)液成分一般都比較復雜除一些無機鹽和有機鹽外還需添加維生素激素氨基核苷酸等營養(yǎng)成分以及血清等物質(zhì)不同動物胚胎移植的時間不同例如牛羊一般要培養(yǎng)到桑椹胚階段囊胚階段才進移植小鼠和家兔等實驗動物可在更早的階段移植，人的體外受精胚胎，即試管胚胎，可在8～6個細胞階段移植3.3胚胎工程的應用及前景一、胚胎移植1、胚胎移植的概念胚胎移植是指，將雌性動物體內(nèi)的早期胚胎，或者通過體外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同種的生理狀態(tài)相同的其他雌性動物的體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。其中提供胚胎的個體稱為“供體，接受胚胎的個體叫“受體。胚胎移植實際上是生產(chǎn)胚胎的供體和孕育胚胎的受體共同繁殖后代的過程。在胚胎工程中通過任何一項技術(shù)如轉(zhuǎn)基因核移植或體外受精等技術(shù)獲得的胚胎都必須移植給受體才能獲得后代。因此，胚胎移植又是胚胎工程其他技術(shù)的最后一道“工序2、胚胎移植的現(xiàn)狀和意義進行胚胎移植的優(yōu)勢是可以充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖潛力在這項技術(shù)中供體的主要職能變?yōu)橹簧a(chǎn)具有優(yōu)良遺傳特性的胚胎繁重而漫長妊娠和育仔的任務由受體取這就大大縮短了供體本身的繁殖周期同時在對供體實行超數(shù)排卵處理后，可獲得多枚胎，經(jīng)移植可得到多個后代，使供體生產(chǎn)下的后代數(shù)是自然繁殖的十幾倍到幾十倍。3、胚胎移植的生理學基礎第一哺乳動物發(fā)情排卵后不管是否妊娠在一段時間內(nèi)同種動物的供受體生殖器官的生理變化是相同的這就為供體的胚胎移入受體提供了相同的生理環(huán)境第二哺乳動物的早期胚胎形成后在一定時間內(nèi)不會與母體子宮建立組織上的聯(lián)系而是處于游離狀態(tài)這就胚胎的收集提供了可能第三大量的研究已經(jīng)證明受體對移入子宮的外來胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥反應為胚胎在受體內(nèi)的存活提供了可能。第四供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理組織聯(lián)系但移入受體的供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受任何影響。討論：1.在胚胎移植操作中怎樣能使胚胎在移植前后所處的生理環(huán)境保持一致？例如供受體的發(fā)情時間要一致嗎？供體胚胎移入受體子宮的位置，應與在供體內(nèi)的位置相同或相似嗎？答應對供體和受體母畜進行同期發(fā)情處理使它們的生理條件達到同步或一致這樣才能使供體的胚胎移入受體后有相同或相似的生存條件這是胚胎移植成功與否的關鍵因此必須做到供受體母畜的發(fā)情時間一致同時還要做到移入受體子宮胚胎的位置應該與其在供體內(nèi)的位置相同或相似，移入胚胎一側(cè)的受體子宮角對應的卵巢必須有黃體存在。2.概括胚胎移植的實質(zhì)。答：可以把胚胎移植簡單概括為早期胚胎在相同生理環(huán)境件下空間位置的轉(zhuǎn)移4、胚胎移植的流程①對供受體母牛進行選擇并用激素進行同期發(fā)情處（種激素主要是孕激素配合使用前列腺素和促性腺激素。對供體母牛的要求是生產(chǎn)和遺傳性能優(yōu)良；對受體母牛的要求是健康、繁殖能力正常②用促性腺激素對供體母牛超數(shù)排卵處理。③超數(shù)排卵的母牛發(fā)情后，選擇同種優(yōu)秀的公牛進行配種或人工授精。④胚胎的收集：配種或輸精后第7天，用特制的沖卵裝置把供體母牛子宮內(nèi)的胚胎沖出來（也叫沖卵⑤沖卵后，對胚胎進行質(zhì)量檢查。這時的胚胎應該發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段。⑥將收集的胚胎直接向受體移植或放入-16℃液氮中保。⑦胚胎的移植：術(shù)法：引出受體子宮和卵，將胚胎注入子宮角，縫合創(chuàng)口。非手術(shù)法：將裝有胚胎的移植管送入受體母牛子宮的相應部位，注入胚胎。⑧對受體母牛進行是否妊娠檢查。⑨受體母牛產(chǎn)下胚胎移植的犢牛。二、胚胎分割胚胎分割是指采用機械方將早期胚胎切割成2等份4等份或8等份等經(jīng)移植獲同卵雙胎或多胎的技術(shù)來自同一胚胎的后代具有相同的遺傳物質(zhì)，因此，胚胎分割可以看做動物無性繁殖或克隆的法之一。胚胎分割所需要的主要儀器設備為實體顯微鏡顯微操作儀。進行胚胎分割時應選擇發(fā)育良好形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚將其移入盛有操作液的養(yǎng)皿中然后分割針或分割刀進行分割。對于不同發(fā)階段的胚胎，分割的具體操作不完全相同。具體操作時用分割針或分割刀片將胚胎切開吸出其中的半個胚胎注入預先準備好的空透明帶中或直接將裸半胚移植入受體。在對囊胚階段的胚胎進行分割時，要注意將內(nèi)細胞團均等分割，否則會影分割后胚胎的恢復和進一步發(fā)育實踐證明采用胚胎分割技術(shù)產(chǎn)生同卵多胚的可能性是有限的到目前為止最常見的是經(jīng)分割產(chǎn)生的同卵雙胎而同卵多胎成功的比例都很小。三、胚胎干細胞哺乳動物的胚胎干細胞簡稱或EK細胞是早期胎始性腺中分離出來的一類ES細胞具有胚胎細胞的特性，在形態(tài)上，表現(xiàn)為積、核仁明顯；在功能上，具發(fā)育的全能性，即可以分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織細胞。另外，在體外培養(yǎng)的條件下，ES細胞可增而不分化。對它可以進行冷凍保存，也可進行遺傳改造。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過ES細胞體外誘導分化，還以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在體器官不足器移植后疫排斥問題。ES細胞也是研究體外細胞分的理想材料。ES細胞養(yǎng)細胞上（一般為輸卵管上皮細胞，在干細胞培養(yǎng)時，可作為提供干細胞分裂增殖的營養(yǎng)細胞或在添抑因子培養(yǎng)液能夠維持不分化的狀態(tài)在培養(yǎng)液中加誘分因子，如牛黃酸、丁酰環(huán)腺苷酸等化學物質(zhì)時，就可以誘導ES細胞向不同類型的組織細胞分化，這為揭示細胞分化和細胞凋亡的機理提供了有效的手段。四RPR胚胎的別鑒定術(shù)對移植前的胚胎進行性別鑒定然后移入受體可以控制后代的性別這種控制是在精子和卵子受精后胚胎本身已經(jīng)有了性別的前提下進行的。目前最有應用前景的方法是S—PR法。操作的基本程序是：先從被測胚胎中取出幾個細胞（一般養(yǎng)層細胞，提取NA，然用位于Y染色體上的性別決定基因即SY基因的一段基引物