人體寄生蟲分子生物學與免疫學研究進展演示文稿

人體寄生蟲分子生物學與免疫學研究進展演示文稿當前1頁，總共70頁。人體寄生蟲分子生物學與免疫學研究進展當前2頁，總共70頁。按動物分類系統(tǒng)分類，人體寄生蟲隸屬于動物界的五個門：原生動物門（PhylumProtozoa)——原蟲扁形動物門（PhylumPlatyhelminthes)——吸蟲、絳蟲線形動物門（PhylumNemathelminthes)——蛔蟲棘頭動物門（PhylumAcanthocephala)——棘頭蟲節(jié)肢動物門(PhylumArthropoda)————醫(yī)學昆蟲

習慣上分為：原蟲、蠕蟲(吸蟲、絳蟲、線蟲)、醫(yī)學昆蟲三大類。2人體寄生蟲分類當前3頁，總共70頁?，F代熱帶?。╓HO2000）瘧疾（malaria）感染人數4億～4.9億；每年死亡人數220～250萬。血吸蟲病（schistosomiasis）流行于76個國家，5億~6億人口受威脅，2億人感染，每年死亡人口50～100萬。

絲蟲病（淋巴和盤尾絲蟲病filariasis)

流行于80多個國家，1.45億人感染。3寄生蟲的危害性當前4頁，總共70頁。晚期絲蟲病人（下肢象皮腫）晚期血吸蟲病人當前5頁，總共70頁。利什曼?。╨eishmaniasis）現感染人口1200萬人錐蟲病（非洲和美洲錐蟲trypanosomiasis）單單美洲錐蟲感染者1800萬。麻風?。╨eprosy）結核病（tuberculosis）登革熱（date-fever）媒介昆蟲傳染的疾病當前6頁，總共70頁。東方癤當前7頁，總共70頁。4背景：

動物寄生蟲的分子生物學研究始于20世紀90年代中期，雖然起步較晚，但進展極快。近10年來，研究廣度已涉及所有重要的寄生原蟲，并已擴展到了具有重要公共衛(wèi)生意義的部分寄生蠕蟲，研究深度已進入寄生蟲的基因序列測定分析、分類比對鑒定、診斷方法的建立和免疫學研究領域，建立了近50種寄生蟲的cDNA文庫。當前8頁，總共70頁。5意義：☆揭示生命科學的規(guī)律。☆為動物寄生蟲病的研究和防控工作展示了新的前景。當前9頁，總共70頁。二、寄生蟲基因組學研究進展1.寄生蟲的基因組成和特點

相對于高等脊椎動物,寄生蟲基因組除了核(染色體)DNA之外,還有線粒體(mitochondrian)DNA、動基體(kineto-plast)DNA（利什曼原蟲，分類和臨床診斷）和質體(plastid)DNA（頂復門寄生蟲，如：瘧原蟲、弓形蟲、巴貝蟲和艾美球蟲，分類和臨床診斷）等。在一些低等的寄生原蟲中,甚至沒有成型的線粒體DNA,如某些阿米巴除了染色體DNA外,只有類似細菌質粒的環(huán)狀DNA和胞質DNA。當前10頁，總共70頁?；蚪M大小:寄生蟲染色體基因組的大小差別較大,其中,微孢子蟲Microsporidia基因組的大小不到10Mb,在整個真核生物中最小;血吸蟲基因組為270Mb,相當于人類基因組的1/10重復序列：高度、中度和單拷貝重復序列,不同的寄生蟲重復序列所占的比例不同堿基含量:寄生蟲基因組堿基G+C含量在30%-40%之間,AT含量豐富當前11頁，總共70頁。線粒體DNA：

線粒體DNA具有母系遺傳和快速進化的特點,較染色體DNA更易反映種、株乃至型間差異,由于具有較好的穩(wěn)定性,因此通常被用來評價物種的種系發(fā)生。目前已對血吸蟲、惡性瘧原蟲、弓形蟲、單殖吸蟲(Microcotylesebastis,G.thymalli,G.salaris,G.derjavin-oides)、血吸蟲(S.japonicum,S.mekongi,S.mansoni,S.haematobium,S.spindale)、肝片吸蟲Fasciolahepatica、衛(wèi)氏并殖吸蟲Paragonimuswestermani及絳蟲(Hymenolepisdiminuta,Taeniaasiatica,T.solium,T.crassiceps,E.multilocularis,E.granulosus)等多種寄生蟲的全線粒體基因組作了測序分析(Littlewoodetal.,2006;Valles&Boore,2006;Parketal.,2007;Plaisanceetal.,2007;Huyseetal.,2007、2008)。當前12頁，總共70頁。2.寄生蟲基因組測序現狀目前寄生蟲基因組測出的序列主要分3類:A.完整或接近完整的基因組序列,主要是可讀框區(qū)的重復序列,通常用重疊群(contigs)表示;B.基因組測序序列標簽(GSSs),主要有瀏覽基因組序列產生或隨機克隆、細菌人工載體(BAC)末端序列,用來擴增大片段的DNA（200kb左右);C.表達序列標簽(ESTs),由mRNA轉錄產生的cDNA,并擴增后進行的測定序列。已經完成基因組測序的寄生蟲包括惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲P.yoelii、馬來布魯線蟲Brugiamalayi、克氏錐蟲T.cruzi、小隱孢子蟲Cryptosporidiumparvum及岡比亞按蚊Anophelesgambiae等的基因組全序列當前13頁，總共70頁。當前14頁，總共70頁。意義：☆基因組分析過程中發(fā)現了大約200種蛋白的基因，這些蛋白質參與了免疫逃避。以前的研究顯示，在某種復雜的掩護機制之下，寄生蟲通過在細胞表面表達不同的蛋白質來逃避宿主的免疫反應?！畎l(fā)現編碼參與代謝途徑蛋白的基因，蟲體存在而人體不存在的特有途徑中的基因是潛在的藥物靶標。當前15頁，總共70頁?！畋容^惡性瘧原蟲與瘧原蟲其他種的序列，可以闡明特定株特異性的基因和生理過程?；蛘弑容^惡性瘧原蟲不同株的序列，可以快速地鑒定與免疫、發(fā)病機制和人侵有關的變異?！钔ㄟ^功能基因組高通量技術進行大規(guī)模的實驗。設計DNA微陣列檢測基因的表達。例如，分離不同時期的DNA微陣列，確定基因的表達變化，對于特別重要的基因可用敲除或修飾的方法來確定功能。當前16頁，總共70頁。當前17頁，總共70頁?？菔襄F蟲——DNA復制和修復機器;布氏錐蟲——代謝的途徑和一些細胞生物學;碩大利什曼原蟲——不尋常的基因表達等問題；基因組都是單倍體，長度從25到55Mb大小不等；多數基因都以長且定向的聚集方式組合在一起，暗示主要是以多順反子地形式進行轉錄，隨后被切割成單獨的mRNA分子。當前18頁，總共70頁。

在三個基因組中很少發(fā)現表達轉錄因子的基因存在，但高表達一些含有RNA結合基序的蛋白質。這些觀察結果支持了先前的觀點，就是錐蟲基因表達的調控主要發(fā)生在轉錄后水平。缺乏轉錄水平的精確調控帶來了一個有趣的結果：

只有通過基因的復制或擴增來增加表達水平的提高。當前19頁，總共70頁。

從DNA復制和修復的角度來看，錐蟲類和真核生物的其他生物區(qū)別很大?；蚪M不包含牽涉到應對氧脅迫的基因；復制起始裝置更像古菌，而非真核生物（生物學和進化學上的興趣）。錐蟲類特異性蛋白激酶，類細菌的線粒體DNA聚合酶，以及特殊的表面蛋白修飾都可以作為潛在的藥物靶位點。

當前20頁，總共70頁。當前21頁，總共70頁。當前22頁，總共70頁。

編碼基因13469個,其中有首次發(fā)現的與血吸蟲感染宿主密切相關的彈力蛋白酶基因。日本血吸蟲一方面丟失了很多與營養(yǎng)代謝相關的基因,如脂肪酸、氨基酸、膽固醇和性激素合成基因等,這些營養(yǎng)物質必須從哺乳動物宿主獲得;另一方面,擴充了許多有利于蛋白消化的酶類基因家族的成員。與宿主相互作用蛋白。當前23頁，總共70頁。當前24頁，總共70頁。當前25頁，總共70頁。WellcomeTrustSangerInstitute原蟲：瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、弓形蟲、孢子蟲…蠕蟲：包括蛔蟲、肝包蟲、馬來絲蟲，捻轉血矛線蟲，管圓線蟲…當前26頁，總共70頁。當前27頁，總共70頁。

絳蟲丟失了homeobox

基因和一些干細胞關鍵基因如piwi蛋白基因，同時也發(fā)現熱休克蛋白70和其他一些抗原基因存在種特異性擴增。比較結果發(fā)現，絳蟲存在特異的解毒途徑，以及依賴宿主營養(yǎng)物質的代謝方式。確定了現有藥物可能的作用靶點，為研發(fā)高效新疫苗和新藥物提供理論支持，給有效預防和控制絳蟲病帶來新的希望。當前28頁，總共70頁。第三代測序技術◆它實現了DNA聚合酶內在自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，是化學法測序的2萬倍?！羲鼘崿F了DNA聚合酶內在自身的延續(xù)性，一個反應就可以測非常長的序列。二代測序現在可以測到上百個堿基，但是三代測序現在就可以測幾千個堿基?！艟雀?，達到99.9999%。當前29頁，總共70頁。二、微衛(wèi)星DNA的研究進展及其在寄生蟲學的應用定義：微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA),又稱短小串連重復序列(shorttandemrepeats,STR)或簡單重復序列(simplerepeatssequence,SRS或SSR)。相對于衛(wèi)星序列和小衛(wèi)星序列,微衛(wèi)星的重復序列更短,一般只有1bp~6bp、長度僅為幾百個bp的位點。微衛(wèi)星重復類型有兩種,即單核苷酸(A/T、C/G等)和4種二核苷酸(AT/TA、AG/TC、TG/AC、CG/GC)。AC/TG約占50%以上,三、四核苷酸重復類型和其他類型的要少一些。

當前30頁，總共70頁。優(yōu)點：

微衛(wèi)星DNA具有RFLP、SSLP、RAPD等遺傳標記技術無法比擬的優(yōu)勢☆種類分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性、重組率低,☆在群體中變異范圍大、長度多態(tài)性豐富、高度個體特異性、基因組中且分布比較均勻☆基因片段小、容易操作☆遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律、能提供眾多有高度遺傳信息的新的多態(tài)性標記當前31頁，總共70頁。意義：微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標記被應用于動植物遺傳育種、遺傳圖譜的構建、群體遺傳學研究、疾病相關基因、免疫和遺傳變異機制的研究。當前32頁，總共70頁。寄生蟲微衛(wèi)星DNA

寄生蟲與宿主在進化過程中的相互關系,為闡明寄生蟲的進化史提供更有價值的依據;宿主對寄生蟲免疫機制;抗藥性蟲株的變異機制及寄生蟲藥物的篩選;影響寄生蟲流行和傳播的因素,這些因素如何導致變異等方面。

當前33頁，總共70頁。當前34頁，總共70頁。三、寄生蟲的反式剪接定義：反式剪接最早發(fā)現于錐蟲(Trypanosome)可變表面糖蛋白(VSG)基因中。VSG基因轉錄后成熟mRNA5′端35bp是其基因中沒有的,這段序列來自另外一基因的小外顯子(miniexon)或SL(splicedleader),這段外來的序列與VSG的mRNA5′端接合形成成熟的mRNA。這種由來自不同基因mRNA通過剪接形成成熟mRNA的剪接方式稱為反式剪接。SL反式剪接廣泛存在于低等真核生物中,雖然各種生物體SLRNA長度,SLDNA長度,SL基因拷貝數不盡相同,但SLRNA及SL反式剪接的現象已被廣泛證明,而且越來越多的研究者在關注和應用這一生物現象。當前35頁，總共70頁。反式剪接與順式剪接有相似之處也有不同之處。相同的是它們中都存在典型的剪接位點,都需要同樣的snRNP來參與。當前36頁，總共70頁。特點：SLRNA長約100bp,其中有一Sm樣蛋白結合位點,SLRNA的Sm樣蛋白結合位點和U6SnRNA堿基配對可在體外進行,推測這一反應可能吸引SLRNA于剪接體中,從而觸發(fā)了這一反式剪接的進行。二級結構還有兩個莖環(huán)結構。SLRNA高度甲基化形成帽子結構。突變SLRNA失去高度甲基化形成帽子結構的能力,會導致不能正常地完成反式剪接。反式剪接中至少兩步需要有SR蛋白的參與,在U2SnRNP加到3′端受體之前和之后,SR蛋白發(fā)揮重要作用。主要是通過SR蛋白的RS區(qū)磷酸化來觸發(fā)已和U2SnRNP結合的SLRNA反式剪接。當前37頁，總共70頁。意義：☆應用SL保守序列作為基因標簽來獲得功能性基因或構建SLcDNA文庫。SLcDNA文庫的構建和分析可能為寄生蟲免疫功能基因的篩選，以及研究寄生蟲的階段特異性表達提供了更加方便、快捷的手段。當前38頁，總共70頁。☆

SLRNA反式剪接可作為一種重要的修復RNA外顯子突變的方法,將正?；蚧蚓哂蓄愃乒δ艿幕蚱芜B接到SL序列上,在SL的引導下將正常的RNA序列經反式剪接換下突變的部分,達到修復的目的。當前39頁，總共70頁?！?/p>

原核生物不存在的細胞核,沒有mRNA的后加工過程;真核生物有細胞核,轉錄初始mRNA要經過一系列的后加工過程。而在低等真核生物中的初始mRNA經反式剪接在5′端加上含有高度甲基化的帽子結構(cap4)的SLRNA,似乎與典型真核生物中5′端帽化很相似,從進化角度,這種反式剪接是一種進化過度形式,這種形式是從原始的一共同祖先進化而來,還是不同的群體各自進化而來還有待進一步研究。當前40頁，總共70頁。當前41頁，總共70頁。當前42頁，總共70頁。當前43頁，總共70頁。當前44頁，總共70頁。四、RNA干擾技術在人體寄生蟲研究中的應用進展RNA干擾技術簡介RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種在真核生物中普遍存在的自身防御反應,是內源或外源性雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)引起細胞內有效的特異基因關閉或基因沉默現象。當前45頁，總共70頁。1.dsRNA被RNA酶Ⅲ家族中的雙鏈RNA特異性核酸內切酶Dicer特異性識別,隨后降解為21~23個核苷酸長度的3′末端突出2個核苷酸的siRNA(smallinterferingRNA)。2.siRNA生成后融入一大分子多蛋白復合體——RNA誘導沉默復合體(RISC),siRNA隨即解鏈為正義鏈和反義鏈。3.若目的mRNA中有部分序列與siRNA的反義鏈互補,則siRNA的反義鏈可與之互補配對并將mRNA在互補區(qū)的中間部分降解,從而引起轉錄后的基因沉默。dsRNA/siRNA介導途徑當前46頁，總共70頁。RNAi技術的特點☆高穩(wěn)定性以3′端突出TT堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定,無需象反義核酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期?！罡叨葘Ｒ恍约磀sRNA具有高度的特異性,它只能引起與dsRNA同源的基因表達活性大幅度降低,即RNAi有同源基因依賴性。siRNA除正義鏈3′端的3個堿基在序列識別中不起主要作用外,其他單個堿基改變就可能使RNAi失效,而針對同源基因共有序列的RNAi則導致同源基因共同失活。當前47頁，總共70頁。RNAi技術的特點☆高效性

RNAi機制中存在催化或放大的步驟,少量的dsRNA分子就能完全抑制相應基因的表達,能在低于反義核苷酸幾個數量級的濃度下研究目標基因,比基因敲除更簡單,更快捷。而且,那些在胚胎中敲除后導致死亡的基因,也可以利用RNAi的方法在培養(yǎng)細胞中進行研究?！罡叽┩感?/p>

RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限,在不同細胞間長距離傳遞和維持,在線蟲中干擾效應甚至可以傳到后代去。當前48頁，總共70頁。當前49頁，總共70頁。RNAi技術鑒定布氏錐蟲基因功能當前50頁，總共70頁。當前51頁，總共70頁。當前52頁，總共70頁。五、寄生蟲MicroRNA的研究進展定義：miRNA是一類內源性非編碼的小RNA，在動物中來源于長度約70bp～90bp的前體。前體經過雙鏈RNA特異性的RNaseⅢ-Drosha及RNaseⅢ-Dicer和AGO作用，最終形成18nt～22nt長度的成熟，然后通過與靶mRNA3‘端非翻譯區(qū)(UTR)結合導致靶基因翻譯阻遏或者降解，實現轉錄后抑制調控。

1993年在秀麗新桿線蟲中首次發(fā)現MicroRNA(miRNA)lin-4以及l(fā)et-7，發(fā)現為寄生蟲的轉錄后調控研究提供了新的契機。當前53頁，總共70頁。miRNA和siRNA之間的關系MiRNA：是非編碼的單鏈小分子RNA，在進化上高度保守，通過翻譯抑制調控基因表達而不影響轉錄本的穩(wěn)定性；miRNAs通常是由較大的（70～90nt）的莖環(huán)結構（發(fā)夾結構）前體經Dicer酶切割得到的。miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細胞中，從理論上推測可能參與多種調控作用。siRNA：針對編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個轉錄本都可能有很多個siRNAs，是通過降解目標靶，在轉錄后調控基因表達。也要經Dicer酶切割dsRNA得到。哺乳動物細胞中還沒有找到內源siRNA。當前54頁，總共70頁。血吸蟲MicroRNAXue等在日本血吸蟲中發(fā)現了5種新的miRNA，其中4種具有保守性的miRNA(sja-let-7，sja-miR-71，sja-miR-125和sja-bantam)，1種(sja-miR-new1)為血吸蟲特有。對這5種新的miRNA在日本血吸蟲6個發(fā)育期中表達情況的分析表明，這些miRNA表現出高度的期特異性。☆

let-7：高度的期特異性；毛蚴期非常低，而胞蚴期為毛蚴期的12倍，在尾蚴期達到高峰。因此，推測let-7在中間宿主釘螺中與毛蚴至尾蚴的發(fā)育調控相關?！?/p>

sja-miR-71、sja-bantam：毛蚴期開始表達，尾蚴期達到高峰。而尾蚴是血吸蟲的感染期，當尾蚴進入宿主動物細胞后，sja-miR-71的表達立刻降到最低水平然后進入童蟲期，并在此后的生命活動過程中始終保持在較低的水平。sja-miR-71在尾蚴期的表達量高于童蟲期近1000倍，sja-bantam高達500倍。表達量的變化與生活周期變化相關，與性別無關。當前55頁，總共70頁。藍氏賈第鞭毛蟲MicroRNA藍氏賈第鞭毛蟲是miRNA研究中第一個經過克隆和實驗驗證的原蟲?，F在已經明確，藍氏賈第鞭毛蟲的至少4種miRNA來源于細胞內的小核仁RNA(SmallnucleolarRNA，snoRNA)。起源于snoRNA的具有miRNA功能的小RNA的發(fā)現擴展了寄生原蟲的調節(jié)性小RNA的來源。該研究首次提出miRNA來源于snoRNA，而不是由miRNA基因本身編碼，意味著在miRNA介導的基因沉默過程中很可能有我們尚未發(fā)現的新途徑。這種現象也意味著在寄生蟲和宿主中起源于其它含量豐富的RNA分子(如rRNA，tRNA和snRNA)并且與AGO相關的小RNA很可能也具有調節(jié)基因表達的功能。當前56頁，總共70頁。AGO蛋白在賈第鞭毛蟲發(fā)育過程中起重要作用，它可以特異性地與m(7)G-帽子結合，從而協助miRNA介導的轉錄抑制調控。在Dicer的作用下，snoRNAGlsR17被加工為26nt大小的miRNA(miR2)。熒光素酶(Luciferase)基因在其3‘端包含6個與miR2作用位點一致的序列，將該酶的mRNA與人工合成的miR2共同溫育，則導致熒光素酶的表達量下降40%，而mRNA的穩(wěn)定性并不受影響。因此，miRNA的轉錄調控很可能是通過翻譯阻遏而不是mRNA降解完成的。另一方面，Dicer基因的沉默則會導致細胞中snoRNA不能被分解，相應miRNA在細胞中的含量急劇降低。同時變異表面糖蛋白(Variantsurfaceglycoprotein，VSG)表達不受限制，由單一表達變成多表達，表明調節(jié)藍氏賈第蟲的抗原變異是miRNA的沉默調節(jié)功能之一。當前57頁，總共70頁。六、寄生蟲熱激蛋白的研究進展定義：熱激蛋白（Heatshockproteins，HSPs）是指所有原核生物和真核生物在生長發(fā)育或受到不同理化及病理因素刺激時，機體內新合成或表達量增加的一組蛋白質家族，屬非分泌型蛋白質。熱激蛋白是物種種系發(fā)生中結構和功能最為保守的一類蛋白質，同時也是分子伴侶（Molecularchaperone）中最重要的一類蛋白。熱激蛋白的主要生物學功能是幫助相關蛋白質的折疊（Folding）、移位（Translocation）、復性（Renaturation）和降解（Degradation），以保護生物體細胞免受內外不良因素的損害。當前58頁，總共70頁。作用機理：熱激蛋白通常在細胞應激時產生，其表達非常迅速。應激因素包括高溫、缺氧、缺血、Ca2+含量增高、癌癥和局部損傷感染等多種有害因素，這些因素引發(fā)細胞的應激反應，使原本在正常情況下以單體形式與阻遏蛋白結合而不能結合到熱激元件（Heatshockelement，HSE，即在熱激蛋白基因轉錄中起調控作用的DNA序列）上的熱激因子（Heatshockfactor，HSF，可識別熱激元件）受刺激而與阻遏蛋白分離，與熱激元件特異結合，從而啟動基因轉錄。當前59頁，總共70頁。寄生蟲HSP：在寄生蟲感染宿主過程中，宿主因寄生蟲的入侵而處于應激狀態(tài)，產生對蟲體入侵起保護作用的HSPs。而寄生蟲在入侵宿主的過程中，由于環(huán)境溫度和理化條件的改變，生理和免疫因素的作用，使寄生蟲蟲體也處于應激狀態(tài)，產生參與寄生蟲分化、增強寄生蟲毒力及逃避宿主免疫作用的HSPs。多數寄生蟲的HSPs可作為免疫優(yōu)勢抗原，誘導宿主產生抗體。近年來對寄生蟲HSPs的研究熱點主要集中在原蟲、線蟲、吸蟲等的HSP90、HSP70和HSP60上，也部分涉及sHSP。當前60頁，總共70頁。應用：HSPs的許多特性顯示其具有廣闊的應用前景，如HSP70可以作為一個潛在的亞單位疫苗佐劑協同對抗瘧原蟲的感染。非完整片段的HSP70與完整片段的HSP70比較，兩者顯示相同的疫苗佐劑特性，將前者與瘧疾抗原EB2