蛋白質(zhì)化學(xué)73課件

蛋白質(zhì)化學(xué)ProteinChemistryFireflies:luciferin+ATPErythrocytes:hemoglobinHair,scales,horn:keratin什么是蛋白質(zhì)？蛋白質(zhì)（Protein）是由多種不同的氨基酸，按照一定的順序，通過肽鍵連接形成的一條或多條肽鏈組成的生物大分子。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。形式及功能多樣 蛋白質(zhì)是最豐富的生物大分子，存在于所有的細(xì)胞及細(xì)胞的所有部分。一個(gè)簡(jiǎn)單的細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的差異極大、種類有成千上萬種、分子量從小肽到數(shù)百萬的巨大分子。蛋白質(zhì)的生物功能還表現(xiàn)出極大的多樣性，是生物信息最重要的終產(chǎn)物，是遺傳信息表達(dá)的元件。Protein一詞來自希臘文“Protos”，指“first”或“foremost”，意即“頭等重要”、“第一位的”、“最重要的”。

18世紀(jì)中葉Beccari首次報(bào)道應(yīng)用稀酸、稀堿可從動(dòng)植物組織中分離到含氮類物質(zhì)。1838年荷蘭化學(xué)家Mulder將之應(yīng)用于從動(dòng)植物細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜的有機(jī)含氮化合物。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多、功能各異,是生物體內(nèi)構(gòu)建生命、行使生命活動(dòng)的最主要的功能分子,在幾乎所有的生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵的作用。如果說基因是生命的指導(dǎo)者和構(gòu)建生命的藍(lán)圖，那么蛋白質(zhì)就是組成生命的主要材料,是生命的實(shí)踐者和執(zhí)行者。蛋白質(zhì)將生物體的遺傳信息表達(dá)成生物的性狀,指導(dǎo)生命活動(dòng)，控制生物的代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育及繁殖。蛋白質(zhì)化學(xué)研究史I1838年

Mulder研究了血清、蛋清、蠶絲等物質(zhì)的元素組成后,發(fā)現(xiàn)了組成生物體的復(fù)雜含氮物19世紀(jì)末

從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物分離得到了13種氨基酸,基團(tuán)學(xué)說消聲匿跡1902年

Fischer,Hofmeister同時(shí)提出肽鍵理論1924年

Svedberg發(fā)明超速離心機(jī)（100000rpm,700000g）1930年代

Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽1950年

Pauling提出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本單位：α-螺旋和β-折疊蛋白質(zhì)化學(xué)研究史II1953年

Sanger確定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)1958年

Perutz&Kendrew用X光衍射法確定了肌紅蛋白的立體結(jié)構(gòu)1961年

Anfinsen證明蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)1980年代

蛋白質(zhì)工程的興起1994年

Williams和Wilkins首次提出Proteome(Protein+genome)1997年

第一屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議，蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics)1999年

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)出現(xiàn)蛋白質(zhì)的經(jīng)典分類法II3.衍生蛋白質(zhì)(derivedprotein)i).Primaryproteinderivatives天然蛋白質(zhì)經(jīng)少量變性后的產(chǎn)物1).Gelatin(明膠）膠原蛋白(collagen)加酸水解產(chǎn)物2).Protean水溶性蛋白質(zhì)經(jīng)水、酶、稀酸作用而不溶化3).Metaprotein(變性蛋白質(zhì)）經(jīng)稀酸、稀堿變性后的蛋白質(zhì)4).Coagulatedprotein(凝固蛋白質(zhì)）機(jī)械攪拌,加酒精后形成的不溶物ii).Secondaryproteinderivatives進(jìn)一步分解后的變性蛋白質(zhì)1).primaryproteose(初期蛋白胅）溶于水,加熱不凝固,易鹽析2).secondaryproteose溶于水,加熱不凝固,難鹽析3).peptone(蛋白胨）溶于水,加熱不凝固,不能鹽析4).peptide氨基酸的組成和序列一定的小分子1.酶類,占細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類的絕大部分2.運(yùn)輸?shù)鞍?如albumin,hemoglobin,transferrin等3.收縮運(yùn)動(dòng)蛋白,如actin,myosin,tubolin等4.激素蛋白,如insulin,growthhormone等5.細(xì)胞激動(dòng)素(cytokinin),如EGF,PDGF,IL-2等6.受體蛋白,如insulinreceptor,rhodopsin等7.毒素蛋白,如choleratoxin,ricin,pertussis等8.營(yíng)養(yǎng)貯藏蛋白,如prolamine,glutelin等9.防御蛋白,如IgG等10.結(jié)構(gòu)蛋白,如keratin,collagen等按功能的蛋白質(zhì)分類法對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)有突出貢獻(xiàn)的Nobel獎(jiǎng)獲得者1902年H.E.Fischer

(德，化)

肽鍵理論，多肽合成1910年A.Kossel

(德，醫(yī))

組氨酸、組蛋白的發(fā)現(xiàn)，堿基的發(fā)現(xiàn)1915年W.H.Bragg/W.L.Bragg

(德，物）

用X射線測(cè)定晶體物質(zhì)結(jié)構(gòu)1926年T.Svedberg

(瑞，化)

用超離心手段決定蛋白質(zhì)的分子量1946年J.B.Summer(美，化)

蛋白質(zhì)酶的結(jié)晶，證明酶的本質(zhì)為蛋白質(zhì)1948年A.W.K.Tiselius(瑞，化)

電泳裝置的開發(fā)，血清蛋白的研究1952年A.J.P.Martin/R.L.M.Synge

(英，化〕分配層析發(fā)明，氨基酸的分離1954年L.Pauling

(美，化)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，抗原抗體反應(yīng)理論1958年F.Sanger

(英，化)

胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定1962年M.F.Perutz/J.C.Kendrew(英，化)

X射線確定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)1972年G.M.Edelman/R.R.Porter

(美，醫(yī)〕抗體的化學(xué)構(gòu)造與功能的解明1972年W.H.Stein/S.More(美，化)

RNase的一級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的解明1972年C.B.Anfinsen

(美，化)

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其立體結(jié)構(gòu)1998年S.B.Prusiner

(美，醫(yī))

Prion:蛋白立體結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致疾病蛋白質(zhì)系數(shù)不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。蛋白質(zhì)含量=N含量6.25.不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成材料蛋白質(zhì)用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿處理后，可以得到各種各樣的氨基酸。在動(dòng)植物組織中可以分離得到26-30種不同的氨基酸。第一個(gè)氨基酸早在兩個(gè)世紀(jì)前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，而最后一個(gè)氨基酸在1935年才發(fā)現(xiàn)。直到1965年才搞清楚，只有20種氨基酸才是生命體中合成蛋白質(zhì)的原材料（稱為一級(jí)氨基酸,Primaryaminoacid）。#最近又多了兩種一級(jí)氨基酸天冬酰氨1806Robiquet&Vauquelin天門冬屬植物液甘氨酸1820Braconnot明膠水解物亮氨酸1820Braconnot羊毛、肌肉酪氨酸1849Bopp奶酪絲氨酸1865Cramer蠶絲谷氨酸1866Ritthausen面筋天冬氨酸1868Ritthausen

蠶豆苯丙氨酸1881Schultze羽扇豆芽丙氨酸1881Weyl絲心蛋白賴氨酸1889Drechsel珊瑚精氨酸1895Hedin牛角組氨酸1896Kossel,Hedin奶酪胱氨酸1899Morner牛角纈氨酸1901Fischer奶酪脯氨酸1901Fischer奶酪色氨酸1901Hopkins奶酪異亮氨酸1904Erhlich纖維蛋白甲硫氨酸1922Mueller奶酪蘇氨酸1935McCoyetal奶酪20種氨基酸的發(fā)現(xiàn)年代表一級(jí)氨基酸的結(jié)構(gòu)及旋光性L-氨基酸的基本結(jié)構(gòu)CHH2NCOOHRα碳原子,不對(duì)稱碳原子側(cè)鏈二十種氨基酸除Gly外全是L-型。Pro呢？殘基：肽鏈中，氨基酸之間縮合時(shí)都脫去一個(gè)水分子，脫水后的殘余部分叫殘基（residue),因此蛋白質(zhì)肽鏈中的氨基酸統(tǒng)統(tǒng)是殘基形式。Chiralcarbon氨基酸可以通過R基團(tuán)分類 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的化學(xué)特性對(duì)于理解它們的生物化學(xué)是關(guān)鍵的，依據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的特性，可以將氨基酸分成5類以簡(jiǎn)單化，特別是在生理pH條件下（pH7.0附近），它們的極性或與水發(fā)生作用的趨勢(shì)。氨基酸側(cè)鏈的極性差異極大，從完全非極性或疏水性（水不溶性）到高極性或親水性（水溶性）。非極性（脂肪族）R側(cè)鏈，Ala、Val、Leu及Ile的側(cè)鏈在蛋白質(zhì)分子中易于聚攏在一起，通過疏水作用穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Gly是最簡(jiǎn)單的氨基酸，雖然疏水，但最小的側(cè)鏈對(duì)于疏水作用沒有貢獻(xiàn)。Met的側(cè)鏈有硫酯基團(tuán)?！种О被岱枷阕灏被?，具有芳香環(huán)側(cè)鏈，相對(duì)非極性，都能參與疏水作用，Tyr的羥基能夠形成氫鍵，是一些酶的重要的功能基團(tuán)。Tyr和Trp比Phe是明顯更加極性的氨基酸（羥基及吲哚環(huán)上的N）。芳香氨基酸的紫外吸收曲線比較pH6.0時(shí)Trp和Tyr的紫外吸收光譜，相同條件下，等摩爾數(shù)（10-3M）的Trp的光吸收是Tyr的4倍，兩者最大光吸收的波長(zhǎng)在280nm附近。第三個(gè)紫外光吸收的氨基酸-Phe，對(duì)蛋白質(zhì)光吸收的貢獻(xiàn)很?。ㄎ达@示）。植物常受到逆境條件的危害，其中由干旱和鹽漬引起的滲透脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量影響最大。但植物通過長(zhǎng)期的進(jìn)化已形成了許多機(jī)制抵抗外界的逆境條件。在滲透脅迫下，植物可通過積累一定量的溶質(zhì)降低水勢(shì)，維持植物體內(nèi)的水分平衡，保證植物的正常生長(zhǎng)。這類物質(zhì)包括一系列的含氮化合物(如脯氨酸、多胺等)，分布最廣的是脯氨酸(Pro)。Pro主要以游離狀態(tài)廣泛存在于植物中，它是水溶性最大的氨基酸（50mg/ml），具有較強(qiáng)的水合能力。在植物細(xì)胞生理干旱時(shí)，它的增加有助于細(xì)胞或組織持水。植物中游離脯氨酸含量(干重)甚微(0.2-0.69mg/g)，約占游離氨基酸總量的百分之幾，但受到干旱、鹽漬等滲透脅迫時(shí)，脯氨酸會(huì)大量積累，其含量甚至高達(dá)百倍以上。所有的植物在鹽漬條件下會(huì)發(fā)生游離Pro的積累。如以桿裂絲藻為材料的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度從0提高到40%時(shí)，Pro以外的其余15種氨基酸總量從95mM上升到120mM，而Pro則由2mM增加到278mM。常見氨基酸的溶解度親水指數(shù)L型和D型的由來

甘油醛的旋光性左旋甘油醛的構(gòu)型右旋甘油醛的構(gòu)型按原子序數(shù)法確定了L型和D型氨基酸，但現(xiàn)在L和D已經(jīng)不代表氨基酸的旋光性，只代表氨基酸的絕對(duì)構(gòu)型。為什么？現(xiàn)在為了正確表示左旋和右旋，采用（＋）和（－）的符號(hào)，（＋）代表右旋，（－）代表左旋。從右旋的D型甘油醛出發(fā)，可以合成出左旋的D型乳酸。從這點(diǎn)我們也可以看出物質(zhì)的旋光性與手性原子上的構(gòu)型沒有確定的關(guān)系。右旋D型甘油醛左旋D型乳酸L型氨基酸

與D型氨基酸L-aminoacidD-aminoacid旋光性I旋光性II“黃氏”判斷法

（看CAR的走向）

將H原子靠近自己，觀察CAR的走向，逆時(shí)針（左轉(zhuǎn)）為L(zhǎng)型，順時(shí)針（右轉(zhuǎn)）為D型。

D：dextro

(右)C：carboxylgroup

L：levo

(左)A：aminogroup

R：residueCCARRAL型D型拉丁語(yǔ)中蘇氨酸Thr有四種異構(gòu)體L-別蘇氨酸其他氨基酸的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)上的氨基酸修飾4-Hydroxyproline

在膠原蛋白上5-Hydroxylysine,6-N-methyllysine,

desmosine在結(jié)締組織中Phospho-Ser,-Thr,-Tyr

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白

γ-Carboxyglutamicacid

凝血酶中Pyroglutamicacid

神經(jīng)肽的N端均為氨基酸參入肽鏈后經(jīng)修飾而來蛋白質(zhì)中的氨基酸修飾-羥基化從各種生物分離到的氨基酸已達(dá)250種以上大量出現(xiàn)在膠原蛋白結(jié)締組織4-羥脯氨酸5-羥賴氨酸結(jié)締組織蛋白質(zhì)中的氨基酸修飾-甲基化鎖鏈素，吡啶環(huán)由4個(gè)Lys分子的側(cè)鏈組成，存在于彈性蛋白（elastin）中蛋白質(zhì)上的氨基酸修飾凝血酶信號(hào)傳導(dǎo)γ-羧基谷氨酸O-磷酸絲氨酸游離型氨基酸衍生物Pyroglutamicacid(焦谷氨酸),神經(jīng)肽的N端多數(shù)為焦谷氨酸能夠增加細(xì)胞合成乙酰膽堿、增加乙酰膽堿受體的數(shù)量、加強(qiáng)大腦左右半球之間的信息交流，幫助提高記憶力和頭腦敏銳度。游離型氨基酸衍生物21號(hào)和22號(hào)primaryaminoacid？？？Ornithine（鳥氨酸）;Citrulline（瓜氨酸）5’-Hydroxytryptophan（5-羥色胺）Homoaminoacids（同型氨基酸）3,4-Dihydroxyphenylalanine(DOPA)（多巴）γ-Aminobutyricacid(GABA)Mono,di,tri-iodotyrosine;thyroxineβ-Alanine,……etcSeC（selenocysteine，硒半胱氨酸）

第21個(gè)一級(jí)氨基酸?遺傳密碼字典的破譯，通用性作為遺傳密碼的基本特點(diǎn)之一被人們認(rèn)可。近年來研究發(fā)現(xiàn)了一些例外，除線粒體使用一組密碼子其含義有別于核基因之外，原先被認(rèn)為僅用作終止信號(hào)的無義密碼子在某些情況下可重新詮釋，編碼特定的氨基酸。硒代半胱氨酸就是由UGA無義編碼。第21個(gè)基本氨基酸的密碼（E.coli）：硒代半胱氨酸密碼子為UGA，有特殊的tRNA-Ser與其識(shí)別，Ser結(jié)合入肽鏈，則立即修飾為硒代半胱氨酸是目前已知的第22種參與蛋白質(zhì)生物合成的氨基酸,與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸不同的是，由終止密碼子UAG的有義編碼形成。與之對(duì)應(yīng)的在產(chǎn)甲烷菌中也含有特異的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和吡咯賴氨酸t(yī)RNA(tRNAPyl)，tRNAPyl具有不同于經(jīng)典tRNA的特殊結(jié)構(gòu)。Hao,B.,etal.AnovelUAGencodedresidueinthestructureofamethanogenmethyltransferase.Science296:1462-1466,2002.PyL(Pyrrolysine，吡咯賴氨酸)-第22個(gè)一級(jí)氨基酸?游離型氨基酸衍生物-參與尿素循環(huán)瓜氨酸(存在于尿素循環(huán),從西瓜汁分離到)，與Asp作用生成精胺琥珀酸，再轉(zhuǎn)變?yōu)锳rg而裂解生成尿素鳥氨酸(存在于尿素循環(huán)，與氨甲酰磷酸合成瓜氨酸)游離型氨基酸衍生物-5-羥色胺5-hydroxytryptamine

（5-HT,5-羥色胺

）HO“Thetasteoflove”是松果體素(褪黑素,

melatonin，5-甲氧基-N-乙酰色胺

)和血清素(serotonin)的前體。5-HT作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于松果體和下丘腦，可能參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)。游離型氨基酸衍生物-同型氨基酸

比通常的氨基酸多一個(gè)甲基，如：Homoserine微生物、植物的代謝中間產(chǎn)物

HomocysteineHomocitrulline攝取高Lys含量的食物時(shí)從尿中排出Homomethionine*Met的分解產(chǎn)物，存在于S-adenosylhomo-cysteine和葉酸中.HomocysteineMethionineEpinephrine,腎上腺素tyrosinenorepinephrine去甲腎上腺素3,4-dihydroxyphenylalanineDOPA,多巴3,4-dihydroxyphenylethylalanineDopamine,多巴胺從Tyr衍生出來的重要生理物質(zhì)，其中多巴是一種氨基酸。S-adenosylmethionineS-adenosylhomocysteine游離型氨基酸衍生物-酪氨酸代謝物兒茶酚乙胺游離型氨基酸衍生物-谷氨酸衍生物glutarmicacidGABA,γ-aminobutyricacidcarnitine,肉毒堿（可用來減肥）味精是神經(jīng)遞質(zhì)GABA的直接前體S-adenosylmethionineS-adenosylhomocysteine過量促進(jìn)食欲,促肥胖tetraiiodotyrosine(thyroxine)tyrosinediiodotyrosinemonoiodotyrosine甲狀腺內(nèi)貯存碘的氨基酸t(yī)riiodotyrosine游離型氨基酸衍生物-甲狀腺素氨基酸的理化性質(zhì)無色晶體，熔點(diǎn)較高（200～300℃），水中溶解度各不同，取決于側(cè)鏈。在紫外有特征吸收的僅三個(gè)芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe,利用這一特點(diǎn)，可以通過測(cè)定280nm處的紫外吸收值的方法對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量。氨基酸的理化性質(zhì)

一般物理性質(zhì)氨基酸的光吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力?？梢酝ㄟ^測(cè)定280nm處的紫外吸收值的方法對(duì)蛋白溶液進(jìn)行定量。

苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103SpectroscopyofaminoacidsOnlythearomaticaminoacidsabsorblightintheUVregion紫外光吸收的測(cè)定裝置Lambert-Beerlaw:A=logIo/I=clA:absorbanceIo:intensityoftheincidentlightI:intensityofthetransmittedlight:molarextinctioncoefficient（摩爾消光系數(shù)）(parallelandmonochromatic)同一個(gè)氨基酸分子上可以同時(shí)解離攜帶正電荷和負(fù)電荷，被稱為兩性電解質(zhì)（ampholyte）。在水溶液中，氨基和羧基在不同的pH條件下表現(xiàn)出不同的解離狀態(tài)；當(dāng)氨基酸分子上的電荷總量為零時(shí)（凈電荷為零），該溶液的pH稱為等電點(diǎn)（isoelectricpoint)，以符號(hào)pI來表示。氨基酸的理化性質(zhì)-兩性電解質(zhì)氨基酸的兩性離子兩性離子也稱兩極離子（dipolarion）兩性電解質(zhì)（ampholyte）等電點(diǎn)(isoelectricpoint,

pI)氨基酸、多肽等兩（兼）性電解質(zhì)[ampholyte]在溶液中所攜帶的凈電荷[net

electriccharge]為零時(shí)的溶液的pH值。因此也叫isoelectricpH.比較常見的錯(cuò)誤氨基酸溶液的凈電荷為零；物質(zhì)所帶凈電荷為零時(shí)溶液的pH值；氨基酸的凈電荷為零時(shí)的pH值；氨基酸分子達(dá)到中性時(shí)溶液的pH值；當(dāng)氨基酸、蛋白質(zhì)以離子存在時(shí)，環(huán)境的pH值；解離基團(tuán)的pK值會(huì)發(fā)生較大的變化蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)計(jì)算只是參考值，因?yàn)樵S多基團(tuán)的pK受微環(huán)境的影響而發(fā)生較大變化氨基酸的酸堿滴定曲線1molGly溶于水時(shí)，溶液的pH約為6，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH進(jìn)行滴定的滴定曲線。MoreTitrationCurves氨基酸等電點(diǎn)及解離百分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式：pH=pK+lg([質(zhì)子受體]/[質(zhì)子供體])，可定量計(jì)算氨基酸在某一pH條件下的解離百分?jǐn)?shù)。氨基酸等電點(diǎn)pI值是由兼性離子兩側(cè)基團(tuán)的pK值所決定的。eg:GlyK1=[+H3NCH2COO-][H+]/ [+H3NCH2COOH]K2=[H2NCH2COO-][H+]/ [+H3NCH2COO－] pH=pI時(shí)，+H3NCH2COOH＝H2NCH2COO－K1K2=[H+]22pH=pK1+pK2

pH=(pK1+pK2)/2pI=(pK1+pK2)/2

同理對(duì)含三個(gè)可解離基團(tuán)的氨基酸來說，只要寫出它的電離式，然后取兼性離子兩邊的pK值的平均值，即得其pI值。

氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算

側(cè)鏈不含離解基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的pK1和pK2的算術(shù)平均值：pI=(pK1+pK2)/2

pH<pI,帶正電；pH=pI,不帶凈電；pH>pI,帶負(fù)電。同樣，對(duì)于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK值的算術(shù)平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-

)/2堿性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2二十種基本氨基酸，除His外，在生理pH（pH7左右）下都沒有明顯的緩沖容量，因?yàn)檫@些氨基酸的表觀解離常數(shù)都不在pH7附近，緩沖容量只有在接近表觀解離常數(shù)值時(shí)才表現(xiàn)出來。His咪唑基的解離常數(shù)為6.0，在pH7附近有明顯的緩沖作用。血紅蛋白含有較多的His殘基，在pH7左右的血液中具有明顯的緩沖能力，對(duì)運(yùn)輸氧和二氧化碳重要。氨基酸的主要化學(xué)反應(yīng)●850℃左右分解成？

●氨基的化學(xué)反應(yīng):◆與茚三酮(ninhydrin)的反應(yīng)

定量反應(yīng)

◆與亞硝酸的反應(yīng)VanSlyke定氮◆與2,4-二硝基氟苯(FDNB)的反應(yīng)

測(cè)序◆與甲醛的反應(yīng)氨基滴定◆與?；姆磻?yīng)氨基保護(hù)基◆與二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)的反應(yīng)測(cè)序◆與熒光胺的反應(yīng)微量檢測(cè)

■與Edman試劑(苯異硫氰酸)和測(cè)序

有色Edman試劑的反應(yīng)氨基酸的化學(xué)性質(zhì)（I）-氨基參與的反應(yīng)

-與亞硝酸反應(yīng)(VanSlyke定氮)用途：范斯來克法定量測(cè)定氨基酸的基本反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定生成氮?dú)獾捏w積，可計(jì)算氨基酸的量，用于氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度的測(cè)定。注意：生成的N2只有一半來自氨基酸、側(cè)鏈氨基？？-氨基參與的反應(yīng)

與甲醛發(fā)生羥甲基化反應(yīng)羥甲基氨基酸二羥甲基氨基酸用途：可以用來直接測(cè)定氨基酸的濃度。-氨基參與的反應(yīng)

-烴基化反應(yīng)（DNFB法）二硝基氟苯（DNFB）法（桑格反應(yīng)，Sangerreaction）用途：是鑒定多肽N-端氨基酸的重要方法pH8-9-氨基參與的反應(yīng)

-烴基化反應(yīng)(Sanger法)Sanger法N端測(cè)序。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。用途：是鑒定多肽N-端氨基酸的重要方法-氨基參與的反應(yīng)

-烴基化反應(yīng)(PITC法）Edman氨基酸順序分析法（苯異硫氰酸酯PITC法），實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。用途：是鑒定多肽N-端aa和aa順序的重要方法-氨基參與的反應(yīng)

-?；磻?yīng)(丹磺酰氯法）用途：是鑒定多肽N-端氨基酸的重要方法。在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯DNS-Cl）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸(DNS-AA)。此方法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到110-9mol。-氨基參與的反應(yīng)

-?；磻?yīng)（氨基保護(hù)反應(yīng)）＋HX用途：用于保護(hù)氨基以及肽鏈的合成。-氨基參與的反應(yīng)

-生成西佛堿用途：是多種酶促反應(yīng)的中間過程。-氨基參與的反應(yīng)

-脫氨基反應(yīng)用途：酶催化的反應(yīng)?！耵然幕瘜W(xué)反應(yīng)▲Strecker降解:

弱氧化劑(次氯酸鈉,N-bromosuccinimide)作用下生成NH3和醛(RCHO)▲特殊條件下,還原成氨基醇、氨基醛▲與肼(hydrazine)的反應(yīng)C端氨基酸分析●側(cè)鏈的化學(xué)反應(yīng)▲羥基:酯化(生物體內(nèi)的磷酸化)▲巰基:氧化還原氨基酸的化學(xué)性質(zhì)（II）-羧基參與的反應(yīng)

-成鹽成酯反應(yīng)a.AA+NaOH－→氨基酸鈉鹽(氨基酸的堿金屬鹽能溶于水，重金屬鹽不溶于水)b.HCl

AA+EtOH－→氨基酸乙酯的鹽酸鹽當(dāng)AA的-COOH變成甲酯、乙酯或鈉鹽后，-COOH的化學(xué)反應(yīng)性能被掩蔽或者說COOH被保護(hù)，-NH2的化學(xué)性能得到了加強(qiáng)或活化，易與?；Y(jié)合。為什么AA的酰基化和烴基化在堿性溶液中進(jìn)行？-羧基參與的反應(yīng)

-形成酰鹵的反應(yīng)-羧基參與的反應(yīng)

-疊氮化反應(yīng)用途：常作為多肽合成活性中間體，活化羧基。-羧基參與的反應(yīng)

-脫羧（基）反應(yīng)用途：脫羧酶催化的反應(yīng)根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)，歷史上曾研究出了每種氨基酸側(cè)鏈的特異性反應(yīng)，可以用來定性和定量分析，但現(xiàn)在已經(jīng)基本棄用。氨基酸的化學(xué)性質(zhì)（III）-氨基和羧基共同參與的反應(yīng)

-與茚三酮反應(yīng)（氨基酸定性、定量分析）茚三酮水合茚三酮還原茚三酮紫色產(chǎn)物Pro、Hypro??-氨基和-羧基共同參與的反應(yīng)

-成肽反應(yīng)用途：是多肽和蛋白質(zhì)合成的基本反應(yīng)巰基（-SH）的反應(yīng)

-側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)（與重金屬反應(yīng)）作用：與金屬離子的螯合性質(zhì)可用于體內(nèi)解毒巰基（-SH）的反應(yīng)

-側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)作用：氧化還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵形成或斷裂。巰基的氧化及二硫鍵的還原巰基（-SH）的反應(yīng)

-側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)+6HCOOH6HCOOOH作用：氧化還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵斷裂。二硫蘇糖醇(DTT)也可以用來打開胱氨酸上的二硫鍵。DTT巰基（-SH）的反應(yīng)

-側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)（與碘乙酸反應(yīng)）羥基的反應(yīng)

-側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)二異丙基氟磷酸酯,DFP、DIPF、DIFP+HF作用：可用于修飾蛋白質(zhì)。氨基酸的應(yīng)用氨基酸的應(yīng)用-醫(yī)藥工業(yè)氨基酸輸液必需氨基酸：甲硫氨酸、色氨酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸(假設(shè)來寫一兩本書）半必需氨基酸：精氨酸、組氨酸是幼兒所必需的。必需氨基酸作用Leu促進(jìn)睡眠、減緩疼痛、緩解酒精中毒Lys減低感染、提高注意力、幫助脂肪酸分解Phe降低饑餓感、改善記憶、消除抑郁Ile/ValHb形成所必需、調(diào)節(jié)糖和能量水平、修復(fù)肌肉組織、加快愈合、防治肝衰竭Thr協(xié)助蛋白質(zhì)吸收利用、防止肝中脂肪積累、促進(jìn)抗體生成增強(qiáng)免疫M(jìn)et幫助分解脂肪、可預(yù)防脂肪肝/心血管及腎臟疾病、消除重金屬及抗氧化Trp減輕焦燥不安、促進(jìn)睡眠、控制酒精中毒氨基酸的應(yīng)用-治療藥劑Arg：對(duì)治療高氨血癥、肝機(jī)能障礙等疾病頗有效果；Asp：鉀、鎂鹽可用于恢復(fù)疲勞；治療低鉀癥心臟病、肝病、糖尿病等。Cys：能促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)，可用于治療禿發(fā)癥；甲酯鹽酸鹽可用于治療支氣管炎等；His：可擴(kuò)張血管，降低血壓，用于心絞痛，心功能不全等疾病的治療。氨基酸的應(yīng)用-食品工業(yè)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑；谷氨酸單鈉鹽—味精；天冬氨酸鈉：可用于清涼飲料，能增加清涼感并使香味濃厚爽口；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素（APM）氨基酸的應(yīng)用-農(nóng)業(yè)殺蟲劑：刀豆氨酸、5-羥色氨酸可使南方毛蟲拒食而死；半胱氨酸可殺死黃瓜蠅；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸鹽具有較強(qiáng)的殺蚜蟲和殺螨效果；殺菌劑：N-月桂酰纈氨酸可用作治療稻瘟病；-1，4環(huán)己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；除草劑：如N-3,4-二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等。氨基酸的應(yīng)用-化妝品氨基酸能調(diào)節(jié)皮膚pH的變化，對(duì)細(xì)菌有抑制作用，也可作為皮膚、毛發(fā)的營(yíng)養(yǎng)成分，增加皮膚、毛發(fā)的光澤。防止皮膚干燥的自然保濕因子的主要成分是甘氨酸、羥基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、絲氨酸等游離氨基酸。在化妝品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些維生素，可防止皮膚老化。氨基酸的應(yīng)用-化學(xué)工業(yè)維生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸為原料合成。葉酸：需要用谷氨酸為原料合成。氨基酸表面活性劑：酰基谷氨酸鈉、十六烷基-L-賴氨酰-L-賴氨酸甲酯二鹽酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯鹽酸等具有較強(qiáng)的抗菌殺菌活性，且無刺激性。聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作為合成皮革的表面處理劑；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯與磷酸高級(jí)烷基酯結(jié)合得到的化合物可作為可塑劑，穩(wěn)定劑等。氨基酸的鑒定、分離純化氨基酸的鑒定凡是具有游離氨基的氨基酸（α-氨基酸）能與茚三酮試劑反應(yīng)，生成紫色化合物。這種反應(yīng)非常靈敏，是鑒定α-氨基酸（除脯氨酸外）的最簡(jiǎn)便、最迅速的方法，可用于-氨基酸的比色測(cè)定和紙上層析的顯色。茚三酮試劑：0.2%的茚三酮酒精（95%酒精）溶液。氨基酸的分離分析分配柱層析：支持劑是一些具有親水性的不溶性物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。濾紙層析（分配層析）薄層層析（吸附層析、分配層析）離子交換層析：陰離子交換樹脂-N(CH3)3OH，陽(yáng)離子交換樹脂-SO3H電泳（紙電泳）分配層析的一般原理1941年Martin與Synge（英）提出分配層析。所有的層析系統(tǒng)都有兩個(gè)相組成，一個(gè)為固定相或靜相(stationaryphase)，一個(gè)為流動(dòng)相或動(dòng)相(mobilephase)，混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于混合物在兩相中的分配情況。分配定律：當(dāng)一種溶質(zhì)在兩種一定的互不相溶的溶劑中分配時(shí)，在一定的溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)。即分配系數(shù)(partitionordistributioncoefficient)（kd）。Kd＝CA/CB

(1891,Nernst)CA：在A相（動(dòng)相）中的濃度

CB：在B相（靜相）中的濃度物質(zhì)分配：液－液固－液氣－液，層析系統(tǒng)的靜相可以是固相、液相或固液混合相，動(dòng)相可以是液相或氣相，它們充滿于靜相的空隙中并能流過靜相。有效分配系數(shù)：Keff=某一物質(zhì)在A相中的總量/某一物質(zhì)在B相中的總量對(duì)液—液層析系統(tǒng)：Keff=CA×VA/CB×VB=Kd×Rv

VA：A相的體積VB：B相的體積

RV＝A、B兩相的體積比Keff是RV的函數(shù)，溶質(zhì)的有效分配系數(shù)可以調(diào)查兩相的體積比而加以改變。分離的先決條件：各種AA成分的分配系數(shù)有差異，差異越大，越容易分開。分配層析的原理：逆流分配

(Countercurrentdistribution)

A：上相，流動(dòng)相B：下相，靜相VA=VBY的Kd=1，Z的Kd=3平衡后，將上相轉(zhuǎn)移到第二管內(nèi)，其中含有相同體積的新下相。eluenteluate濾紙層析

(Filter-paperchromatography)分配層析的一種，濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層(development)用的溶劑是流動(dòng)相，層析是混合氨基酸在兩相中不斷被分配，使它們分配在濾紙的不同位置。濾紙層析是分離及簡(jiǎn)單氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)氨基酸成分的定性鑒定及定量測(cè)定。還可以通過雙向?qū)游?，利用不同的展層劑系統(tǒng)使在兩向系統(tǒng)中不同Rf值的氨基酸分開(two-dimensionalpaperchromatography)。紙層析、薄層層析離子交換柱層析法

(Ion-exchangecolumnchromatography)此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的AA進(jìn)行分離的方法。離子交換樹脂可以分為陽(yáng)離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等）和陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。帶正電荷多的AA與樹脂結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷少的AA與樹脂結(jié)合則較弱。用不同濃度的陽(yáng)離子洗脫液，如NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的AA進(jìn)行分離。也可以用不同pH值的緩沖液洗脫。樹脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）陽(yáng)離子交換樹脂強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂強(qiáng)堿含季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]弱堿含叔胺、伯胺基團(tuán)[-N(CH3)2陰離子交換樹脂對(duì)化學(xué)試劑及熱都不如陽(yáng)離子交換樹脂穩(wěn)定。離子交換纖維素陰離子交換纖維素—如:DEAE-纖維素，pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì)，具二乙胺乙基。陽(yáng)離子交換纖維素—如:CM-纖維素，一般pH>4條件下使用,具有羧甲基。離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose）離子交換層析法離子交換層析氣相色譜

(Gasliquidchromatography，GLC) 當(dāng)層析系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體，固定相為涂漬在固體表面的液體時(shí)，這類層析技術(shù)被稱為氣-液色譜或氣相色譜。原理也是分配過程，利用樣品組分在流動(dòng)的氣相和固定在顆粒表面的液相是分配系數(shù)不同以達(dá)到分離組分的目的。涂有薄層液體的惰性顆粒被裝在一根長(zhǎng)度不銹鋼管或玻璃管中（色譜柱），在適當(dāng)溫度下，令高壓氣體連續(xù)通過色譜柱，待分離樣品在進(jìn)樣室被氣化后流經(jīng)固定相，氣化的樣品在流動(dòng)的氣相和固定相的液相之間發(fā)生分配，將組分分離開來。GasChromatographyFilters/TrapsAirHydrogenGasCarrierColumnDatasystemSyringe/SamplerInletsDetectorsRegulatorsHRESETgassysteminletcolumndetectordatasystem氨基酸由于含有各種極性基團(tuán)，氣化十分困難，必須將它們轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀讚]發(fā)的衍生物才能進(jìn)行氣相色譜。氨基酸與PITC反應(yīng)生成PTH-氨基酸，再經(jīng)三甲基硅烷基化(trimethylsilylation)，可得到很好氣化的氨基酸衍生物。PTH-AA高效液相色譜

(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)曾稱高壓液相色譜，以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法?？焖?、靈敏、高效的分離和分析技術(shù)。固相支持物的顆粒很細(xì)，表面積很大；溶劑系統(tǒng)采取高壓，洗脫速度快。多種類型的柱層析都可以用HPLC代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。參考書籍：GCBarrett:

ChemistryandBiochemistryoftheAminoAcids.

Chapman&Hall,1985.Greenstein&Winitz:

ChemistryoftheAminoAcids.JohnWiley&SonsInc,1961.Cohen:Science267,1265-1266.CRCantor&PRSchimmel:BiophysicalChemistry,ptI,Freesman,1980DLNelson&MMCox:LehningerPrinciplesofBiochemistry(4thedition)%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4bMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(yF7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTk