無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座

目錄主題1：為何要進行培養(yǎng)基灌裝驗證？主題2：相關GMP法規(guī)對培養(yǎng)基灌裝驗證要求主題3：培養(yǎng)基灌封試驗常規(guī)要求主題4：特殊劑型培養(yǎng)基灌裝驗證方法主題5：培養(yǎng)基灌裝驗證設計、執(zhí)行與文件編制主題6：培養(yǎng)基灌裝驗證關鍵點分析主題7：培養(yǎng)基灌裝驗證檢驗關鍵點1無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第1頁主題1：為何要進行培養(yǎng)基灌裝驗證？

2無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第2頁為何需要進行培養(yǎng)基灌封試驗？3無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第3頁幾個概念無菌狀態(tài)Asepsis(FDA指南)：經(jīng)過使用無菌工作區(qū)及預防暴露無菌產(chǎn)品受到微生物污染方式進行操作所到達一個控制狀態(tài)

無菌工藝Asepticprocessing(PDATR22)：在對空氣、物料、設備、人員進行微生物和顆粒物污染嚴格控制環(huán)境下，對無菌物料進行加工。無菌灌裝Asepticfilling(PDATR22)：將預先滅菌產(chǎn)品灌和/或裝入無菌容器中并密封，屬于無菌工藝一個組成部分。關鍵區(qū)Criticalarea(PDATR44)：經(jīng)過設計使產(chǎn)品、容器、封裝件和設備能夠保持無菌性一個區(qū)域。4無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第4頁概況洗瓶機干熱隧道隔離柜凍干機軋蓋機轉(zhuǎn)移瓶塞灌裝機容器5無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第5頁來自生產(chǎn)工藝要求……對產(chǎn)品進行最終滅菌，是降低微生物污染風險慣用方法。但有大量藥品不適合用于最終滅菌而只能采取無菌生產(chǎn)工藝方法。無菌生產(chǎn)工藝是制藥領域中最難工藝之一，確保產(chǎn)品無菌是該工藝最大難點。降低無菌工藝藥品污染風險兩項主要方法人員培訓無菌工藝驗證6無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第6頁最終滅菌工藝與無菌生產(chǎn)工藝差異最終滅菌工藝在高潔凈凈環(huán)境下進行灌裝和密封通常，產(chǎn)品、容器和密封件微生物污染水平很低在密封容器中進行最終滅菌無菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品、容器和密封件分別進行滅菌，然后進行灌封在極高潔凈環(huán)境下進行灌裝和密封產(chǎn)品在最終容器中不再做深入滅菌處理對各個組成部分滅菌工藝需要進行嚴格驗證和監(jiān)控在灌封前和灌封過程中操作會帶來污染風險空瓶滅菌隧道密封件蒸汽滅菌釜除菌過濾人員半壓塞瓶凍干機全壓塞瓶7無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第7頁無菌生產(chǎn)系統(tǒng)8消毒劑滅菌設備清洗設備蒸汽滅菌干熱滅菌水預處理純蒸汽發(fā)生器高風險操作區(qū)域混合灌裝其它VHP,EO發(fā)生器凍干機最終滅菌壓縮空氣無菌檢測8無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第8頁污染類型舉例起源（舉例）處理方法（舉例）非活性（粒子）金屬斑點衣物纖維儀器人員衣物外部空氣供水懸浮粒子由高效過濾器過濾接觸部分清潔和滅菌純化水系統(tǒng)活性（微生物）細菌酵母，霉菌人員水外部空氣儀器工具輔料活性物質(zhì)有限無菌關鍵區(qū)干擾懸浮粒子由高效過濾器過濾溶液無菌過濾（0.2um）蒸汽滅菌或零件輻射滅菌內(nèi)毒素（通常與空氣中細菌無關）起源于某種有機體細胞壁（經(jīng)常水生）潮濕設備或更換零件，或暴露一段時間后容器/密封容器加熱苛性鈉溶液高溫（大于200度）時間視情況而定ISPE：無菌設施設計規(guī)范P169無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第9頁USP注射劑無菌測試結(jié)果試驗目標：不合格可能性(%)試驗批量：60,000支試驗方法：按美國藥典無菌測試方法真實不合格率測試20支樣品不合格可能性測試40支樣品不合格可能性1％18.2%33.1%5％64.2%87.2%15％96.1%99.8%30％99.9%≈100.0%10無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第10頁無菌工藝產(chǎn)品無菌確保

無菌工藝產(chǎn)品PersonnelEnvironment工藝驗證人員原料環(huán)境無菌檢驗11無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第11頁注射劑生產(chǎn)風險分析內(nèi)源性影響原因系統(tǒng)設備工藝過程物料和中間體質(zhì)量外源性影響原因人員12無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第12頁作業(yè)步驟與風險作業(yè)步驟驗證難易度人員依賴程度相關風險滅菌易低低房間設計N/AN/A中等環(huán)境監(jiān)測中等可變高消毒難高高更衣難很高很高物品轉(zhuǎn)移難高高無菌技術（灌封）難很高很高無菌裝配難很高很高13無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第13頁廠房/房間人員無菌工藝生產(chǎn)線工藝人流物流布局HVAC/公用工程*日常無菌確保培養(yǎng)基灌裝QA/QC消毒操作偏差&環(huán)境控制趨勢RichardL.Friedman,M.S.藥品評價及研究中心法規(guī)辦公室，美國FDA*包含設計及維護14無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第14頁為何要進行無菌工藝驗證證實采取無菌工藝生產(chǎn)無菌產(chǎn)品能力無菌工藝人員資格和確保符合現(xiàn)行GMP要求15無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第15頁無菌工藝意義無菌工藝試驗僅證實無菌工藝系統(tǒng)（環(huán)境、設備、程序和人員）能力在某一個時間點表現(xiàn)。并不確保生產(chǎn)程序在同一個生產(chǎn)線不一樣時間段表現(xiàn)出相同微生物質(zhì)量水平。經(jīng)過控制和驗證所以相關工藝，如環(huán)境監(jiān)測、人員確認和清潔、滅菌程序驗證，維持工藝模擬驗證時無菌水平。16無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第16頁主題2：相關GMP法規(guī)對培養(yǎng)基灌裝驗證要求17無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第17頁來自FDA和USP要求FDACGMP無菌工藝藥品指南（年版）Anasepticprocessingoperationshouldbevalidatedusingamicrobiologicalgrowthmediuminplaceoftheproduct.

Thisprocesssimulation,alsoknownasamediafill.USP31<1116>潔凈室和其它控制環(huán)境微生物學評價Toassurethatminimalbioburdenisachieved,additionalinformationontheevaluationofthemicrobiologicalstatusofthecontrolledenvironmentcanbeobtainedbytheuseofmediafills.Anacceptablemediafillshowsthatasuccessfulsimulatedproductruncanbeconductedonthemanufacturinglineatthatpointintime.18無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第18頁來自EUGMP和國內(nèi)要求EUGMP附件1無菌藥品生產(chǎn)（年2月新版）

Validationofasepticprocessingshouldincludeaprocesssimulationtestusinganutrientmedium(mediafill).中國藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄（1998年修訂）SFDA化學藥品注射劑基本技術要求（試行）…培養(yǎng)基灌裝驗證是對設備、環(huán)境以及人員操作一個系統(tǒng)驗證,是判斷無菌確保水平關鍵伎倆…

…采取無菌生產(chǎn)工藝粉針劑，應能確保SAL小于10-3…

19無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第19頁附錄一：無菌制劑第四十七條無菌生產(chǎn)工藝驗證應包含培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。應依據(jù)產(chǎn)品劑型以及培養(yǎng)基選擇性、澄清度、濃度和滅菌適用性選擇培養(yǎng)基。應盡可能模擬常規(guī)無菌生產(chǎn)工藝，包含全部對產(chǎn)品無菌特征有影響關鍵操作，及生產(chǎn)中可能出現(xiàn)各種干預和最差條件。

培養(yǎng)基模擬灌裝試驗首次驗證，每班次應連續(xù)進行3次合格試驗?？諝鈨艋到y(tǒng)、設備、生產(chǎn)工藝及人員重大變更后，應重復進行培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗通常應按生產(chǎn)工藝每班次六個月進行1次，每次最少一批。20無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第20頁培養(yǎng)基灌裝容器數(shù)量應足以確保評價有效性。批量較小產(chǎn)品，培養(yǎng)基灌裝數(shù)量應最少等于產(chǎn)品批量。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗目標是零污染，應遵照以下要求：（1）灌裝數(shù)量少于5000支時，不得檢出污染品；（2）灌裝數(shù)量在5000至10000支時：1.有1支污染，需調(diào)查，可考慮重復試驗；2.有2支污染，需調(diào)查后，進行再驗證。（3)灌裝數(shù)量超出10000支時：1.有1支污染，需調(diào)查；2.有2支污染，需調(diào)查后，進行再驗證。（4）發(fā)生任何微生物污染時，均應進行調(diào)查。21無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第21頁主題3：培養(yǎng)基灌封試驗常規(guī)要求

22無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第22頁定義與目標

目標證實生產(chǎn)線采取無菌工藝生產(chǎn)無菌產(chǎn)品能力對人員進行資格確認符合GMP要求使用培養(yǎng)基模擬藥品進行無菌灌封，對無菌工藝進行驗證。又稱為“工藝模擬試驗”.23無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第23頁工藝模擬試驗通常流程將培養(yǎng)基暴露于設備、容器膠塞密封系統(tǒng)表面和關鍵環(huán)境條件中，并模擬實際生產(chǎn)完成工藝操作。對裝有培養(yǎng)基密閉容器進行培養(yǎng)以檢驗微生物生長。評價結(jié)果，確定實際生產(chǎn)中（如灌裝前調(diào)試、加入無菌原輔材料、無菌連接、灌裝和密封）產(chǎn)品污染可能性。

24無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第24頁工藝模擬過程從滅菌開始到完全灌裝結(jié)束全過程。如處方混合階段采取無菌過程必須作為驗證一部分。配制后除菌、原液保留。如取樣、保留時間、物料循環(huán)等操作。灌裝操作。如容器、設備CIP和SIP；設備依照設定速度和包裝規(guī)格包裝容器等，正常與異常干擾等。凍干工藝過程25無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第25頁模擬條件-最差條件最差條件目標是有意對工藝、系統(tǒng)、設備在更高挑戰(zhàn)條件下進行驗證。使用原料、組件和密封在無菌工藝區(qū)域保留時間超出控制要求；增加灌裝人員數(shù)量，超出正常灌裝生產(chǎn)所需人員數(shù)量；在工藝模擬試驗中使用促生長培養(yǎng)基，而不是使用有抑制性或保護性處方。

HACCP、FEMA、FAT方法確定最差條件26無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第26頁培養(yǎng)基灌封試驗時機：

初始驗證與再驗證初始驗證需要重復屢次，以確保結(jié)果一致性和有效性。有差異屢次試驗結(jié)果工藝過程失控象征定時再驗證定時進行，評定無菌工藝受控情況。應綜合考慮每一班次及班次改變過程中有代表性活動及干預。對人員資格再確認應納入到定時再驗證中。27無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第27頁培養(yǎng)基灌封試驗時機：–增補性培養(yǎng)基灌封試驗變更及其評定對產(chǎn)品或生產(chǎn)線每一個變更，均應依據(jù)書面變更控制系統(tǒng)進行評定。假如經(jīng)過評定認為此項變更會影響到無菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品無菌確保水平，則需要進行增補性培養(yǎng)基灌封試驗。比如，設施或設備改變、生產(chǎn)線配置變動、人員主要變動、環(huán)境監(jiān)控結(jié)果異常、容器-膠塞系統(tǒng)變更、停車時間延長、無菌檢驗結(jié)果陽性等。28無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第28頁試驗用培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度選擇選擇時注意事項適應廣譜微生物生長，包含細菌和真菌很好澄明度，較小粘度易于除菌過濾慣用培養(yǎng)基：3％大豆胰蛋白肉湯（TSB）厭氧培養(yǎng)基僅在特殊情況下使用培養(yǎng)溫度FDA-20-35℃，目標值±2.5℃，不少于14天；如選擇兩個溫度，則每一溫度下最少培養(yǎng)7天，從低溫開始。PIC-20-25℃下最少14天，或，先20-25℃下7天，然后30-35℃下7天。29無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第29頁培養(yǎng)基選擇試驗培養(yǎng)基配制和滅菌培養(yǎng)基驗證分裝到若干數(shù)量無菌小瓶或試管制備三種微生物（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌混懸液，菌液濃度控制在100-1000個菌/ml分別加入菌懸液各0.1ml,每份最少2瓶（支）培養(yǎng)：30-35℃（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌）20-25℃（白色念珠菌））觀察：假如在7天內(nèi)，每種微生物培養(yǎng)據(jù)最少有50%長菌，則可認為培養(yǎng)基可用于無菌工藝驗證。30無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第30頁灌裝體積與數(shù)量灌裝體積每只容器灌裝體積不少于總?cè)莘e1/3一樣，灌裝體積也不宜過大既要考慮到瓶倒轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)時，培養(yǎng)基能充分接觸到容器和密封件內(nèi)表面，又要確保容器內(nèi)有足夠氧氣支持微生物生長。灌封數(shù)量綜合考慮統(tǒng)計學要求和實際生產(chǎn)批量。FDA(>5000瓶)：假如正常生產(chǎn)批次量低于5000瓶，則培養(yǎng)基灌封最少應為實際生產(chǎn)線最大批次量。PIC(>3000瓶)：假如正常生產(chǎn)批次量低于3000瓶，則培養(yǎng)基灌封最少應為實際生產(chǎn)線最大批次量。31無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第31頁灌封時間與批次量控制灌裝時間對于初始性驗證，培養(yǎng)基灌封試驗應安排在一周內(nèi)不一樣時間進行。對于再驗證，可選擇在一周結(jié)束或其它最差條件下進行。灌封時間要涵蓋實際生產(chǎn)班次。批次量控制首次驗證，最少要連續(xù)成功灌封3個批次。再驗證最少需要成功灌封1個批次。32無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第32頁培養(yǎng)基灌封試驗合格標準FDA指南（版）與EUGMP附件1標準統(tǒng)一灌封量<5000瓶時，若有1瓶污染，需徹底調(diào)查，并重新驗證(3批)。灌封量為5000-10000瓶時，若有1瓶污染，視調(diào)查結(jié)果決定是否需要重新進行1批培養(yǎng)基灌封試驗；若有兩瓶污染，必須重新驗證（3批），同時進行徹底調(diào)查。灌封量>10000瓶時，若有1瓶污染，需徹底調(diào)查；若有兩瓶污染，必須進行徹底調(diào)查，并重新驗證（3批）。

注：歐盟標準將自年3月起執(zhí)行。33無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第33頁培養(yǎng)基灌封試驗合格標準年3月以前歐盟通用標準：污染率低于0.1%計算公式：實際污染率=(95%置信限值)/(灌封容器數(shù))×100%污染瓶數(shù)與95%置信限值間關系污染瓶數(shù)01234567891095%置信限值34.746.37.759.1510.5111.8413.1514.4315.7116.9634無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第34頁培養(yǎng)基灌封試驗合格標準SFDA化學藥品注射劑基本技術要求（試行）培養(yǎng)基灌裝試驗批量與判斷合格標準批量（瓶）3000475063007760允許污染數(shù)量（瓶）0≤1≤2≤335無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第35頁主題4:特殊劑型培養(yǎng)基灌裝驗證方法36無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第36頁凍干制劑對培養(yǎng)基灌封要求凍干制劑經(jīng)典生產(chǎn)流程配制→灌裝→凍干→加塞→軋蓋第一個方式，模擬裝載/卸載過程，縮短放置時間（首選）容器內(nèi)灌封好培養(yǎng)基，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機凍干機內(nèi)部分抽真空（500mbar），在室溫放置一定時間，不得冷凍。用無菌空氣破真空（不使用惰性氣體），全壓塞軋蓋缺點:真空度不能過高，不能照成培養(yǎng)基沸騰。注意，若所使用容器透明度不高，應將內(nèi)容物倒出進行檢驗。凍干制劑培養(yǎng)基灌封試驗特殊性對產(chǎn)品在凍干機內(nèi)放置步驟模擬37無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第37頁凍干制劑對培養(yǎng)基灌封要求第二種方式，模擬凍干時間半壓塞產(chǎn)品在凍干機腔室內(nèi)放置時間同于正常工藝。缺點：耗時長第三種方式，以經(jīng)稀釋培養(yǎng)基模擬凍干過程容器內(nèi)灌封好經(jīng)稀釋培養(yǎng)基（dilutedmedium），以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機模擬凍干過程，直到容器內(nèi)培養(yǎng)基大致到達正常濃度（fullstrength）為止。缺點：耗時長，需開發(fā)特殊凍干程序，營養(yǎng)支持性不均一，影響微生物存活力。38無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第38頁粉針劑對培養(yǎng)基灌封要求第一個方法在灌裝線上直接灌裝液體培養(yǎng)基，灌裝后壓塞-軋蓋或熔封。第二種方法先灌裝干粉培養(yǎng)基，再加入注射用水第三種方法先灌裝惰性劑，再加入液體培養(yǎng)基關鍵點采取第二、三種方法時，所用惰性劑或干粉培養(yǎng)基需事先經(jīng)過輻射滅菌。慣用惰性劑有聚乙二醇8000、羧甲基纖維素、乳糖。39無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第39頁混懸劑/半固體制劑對培養(yǎng)基灌封要求懸浮劑需要模擬攪拌或循環(huán)流動過程。假如有沒有菌添加過程，也應進行模擬。半固體制劑需要將液體培養(yǎng)基增稠到適當粘度。可選取瓊脂或羧甲基纖維素作為增稠劑，也可選取其它試劑，但要證實其沒有抑制細菌或真菌作用。在培養(yǎng)結(jié)束后，需將培養(yǎng)基從塑料或金屬管中擠出檢驗其混濁度和真菌菌落，也可進行無菌檢驗試驗。假如選擇顯色培養(yǎng)基碰到污染物變色方法，則需要對其進行驗證。40無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第40頁主題5：培養(yǎng)基灌裝驗證設計、執(zhí)行與文件編制41無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第41頁制訂培養(yǎng)基灌封試驗方案考慮原因（一）生產(chǎn)線最長運行時間及其造成相關風險干預次數(shù)、類型和復雜程度是否有凍干工序設備無菌裝配總?cè)藬?shù)和所從事操作無菌加入和無菌轉(zhuǎn)移次數(shù)班次更換、暫停和必要更衣無菌設備拆卸與連接環(huán)境監(jiān)測42無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第42頁制訂培養(yǎng)基灌封試驗方案考慮原因（二）生產(chǎn)線配置和運行速度產(chǎn)品重量檢驗容器/密封系統(tǒng)與無菌操作相關各種特殊要求總?cè)藬?shù)和所從事操作總標準綜合考慮生產(chǎn)線可能造成污染各種原因

盡可能模擬實際生產(chǎn)無菌操作

可能時，應包含最差條件模擬測試43無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第43頁驗證開始前準備工作設備確認通風系統(tǒng)（HVAC）確實認設備在線清洗和滅菌CIP,SIP滅（除）菌工藝驗證濕熱、干熱滅菌工藝除菌過濾空氣過濾器完好性檢測容器/膠塞密封完好性測試人員培訓潔凈室環(huán)境到達設計要求44無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第44頁培養(yǎng)基灌封試驗方案內(nèi)容舉例定義被模擬工藝定義使用房間，灌封線和設備使用容器和密封件類型灌裝線速度灌封數(shù)量模擬過程中干擾和中止數(shù)目和類型參加人員數(shù)目使用培養(yǎng)基灌封到容器內(nèi)培養(yǎng)基體積選擇最差條件及其原理培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間所進行環(huán)境監(jiān)測批統(tǒng)計復印件職責說明全部工作合格標準列舉最終匯報中需要文件此次模擬連續(xù)時間45無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第45頁方案執(zhí)行與統(tǒng)計（一）培養(yǎng)基灌封日期和時間使用房間和設備容器膠塞型號和尺寸培養(yǎng)基種類和滅菌方式每容器中灌裝體積灌裝速度灌封瓶數(shù)，燈檢丟棄瓶數(shù)和原因培養(yǎng)瓶數(shù)，陽性數(shù)量培養(yǎng)時間和溫度46無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第46頁方案執(zhí)行與統(tǒng)計（二）環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)參加培養(yǎng)基灌封人員培養(yǎng)基靈敏度檢驗結(jié)果有沒有陽性結(jié)果。如有，要給出微生物判定結(jié)果。如發(fā)生異常情況，需給出調(diào)查匯報。47無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第47頁培養(yǎng)基灌封試驗中環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測－按攝影應規(guī)程進行，包含：空氣粒子數(shù)沉降碟浮游菌表面監(jiān)測人員監(jiān)測對無菌生產(chǎn)區(qū)環(huán)境評定48無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第48頁培養(yǎng)基灌封試驗中靈敏度檢驗試驗培養(yǎng)基靈敏度檢驗試驗：使用完成14天培養(yǎng)灌封前期培養(yǎng)基樣品用枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉和環(huán)境菌作為陽性菌將每個菌種準備含<100cfu/0.1ml菌液，每個菌種接種2支培養(yǎng)基樣品，同時并平板計數(shù)（雙份）對真菌在20-25C下培養(yǎng)，對細菌在30-35C下培養(yǎng)，天天檢驗，5天內(nèi)需有生長跡象49無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第49頁再驗證與增補性驗證要求再驗證對每條生產(chǎn)線，每年進行兩次再驗證，間隔時間為5-7個月。人員最少每年參加一次再驗證，以進行資格再確認。每條生產(chǎn)線輪番使用最大和最小規(guī)格容器，變換生產(chǎn)線速度。增補性驗證依據(jù)風險程度決定培養(yǎng)基灌封試驗批數(shù)。通常為1-3批。50無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第50頁培養(yǎng)基灌封試驗總結(jié)匯報最終匯報中應包含以下內(nèi)容模擬最差條件事件清單環(huán)境監(jiān)測結(jié)果微生物判別結(jié)果培養(yǎng)基營養(yǎng)檢驗試驗結(jié)果培養(yǎng)條件、結(jié)果讀取日、結(jié)果讀取人、每位參加者灌裝瓶數(shù)等信息。結(jié)論（結(jié)果是否能夠接收）合格證書工藝驗證/再驗證合格證書人員資格確認證書51無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第51頁培養(yǎng)基灌封試驗陽性結(jié)果調(diào)查(一)調(diào)查范圍應包含環(huán)境微生物監(jiān)測數(shù)據(jù)，空氣懸浮粒子監(jiān)測數(shù)據(jù)CIP設備，清潔、消毒程序執(zhí)行情況培養(yǎng)基、設備和零件滅菌工藝，滅菌釜校正情況高效過濾器檢測(空氣懸浮粒子水平，過濾器檢漏，風速測量，密封系統(tǒng)檢驗，使用年限等)除菌過濾器完好性房間氣流型式與壓差人員操作技術培訓情況52無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第52頁培養(yǎng)基灌封試驗陽性結(jié)果調(diào)查(二)調(diào)查范圍還應包含以往產(chǎn)品無菌檢驗試驗結(jié)果人員衛(wèi)生情況監(jiān)測數(shù)據(jù)培養(yǎng)基灌裝試驗中干預方式分析該區(qū)域近期是否有過維修活動，生產(chǎn)線改造情況該生產(chǎn)線培養(yǎng)基灌封試驗歷史數(shù)據(jù)已滅菌物品儲存條件培養(yǎng)基灌封過程中異常事件陽性污染菌與環(huán)境監(jiān)測污染菌判別53無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第53頁培養(yǎng)基灌封試驗陽性結(jié)果調(diào)查(三)調(diào)查結(jié)論與風險評定培養(yǎng)基灌封試驗結(jié)果有效暫停生產(chǎn)，直至確定污染起源并采取有效糾偏辦法。再驗證合格后，產(chǎn)品方可放行。對培養(yǎng)基灌封試驗后和以前所生產(chǎn)產(chǎn)品，進行風險評定培養(yǎng)基灌封試驗結(jié)果無效→重新進行培養(yǎng)基灌封試驗條件1無菌灌裝區(qū)物理條件不滿足要求條件2人員未按照正常生產(chǎn)程序操作54無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第54頁污染率灌裝過程(時間或灌裝量)在灌裝過程中污染率上升

這表明污染可能起源于液體培養(yǎng)基(如與培養(yǎng)基貯罐非無菌連接，在循環(huán)管路中受到污染)。很主要是，在灌裝結(jié)束后，保持培養(yǎng)基貯罐處于無菌狀態(tài)，當?shù)鹊脚囵B(yǎng)基灌裝結(jié)果時，能夠核實這么假設。55無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第55頁污染率灌裝過程(時間或灌裝量)在灌裝過程中污染率下降這表明污染發(fā)生于生產(chǎn)設備中（膠塞容器/軌道,計量泵/針頭)，在灌裝過程中污染被部分或全部“清洗掉”。56無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第56頁污染率灌裝過程(時間或灌裝量)在灌裝過程中污染率出現(xiàn)尖峰一個尖峰（在短時段一些產(chǎn)品被污染）可能與在灌裝過程中不正確操作造成關鍵失誤相關。對于這個原因，很關鍵是必須知道被污染產(chǎn)品灌裝準確時間，以及當初實施干預辦法（灌裝操作過程錄像是非常有用）57無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第57頁污染率灌裝過程(時間或灌裝量)污染率出現(xiàn)尖峰后，呈上升趨勢

與前面例子相同，但假如錯誤干預辦法能夠影響到液體管路/回路時（如培養(yǎng)基貯罐改變，泵或針替換）58無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第58頁污染率灌裝過程(時間或灌裝量)孤立事件(試驗中少數(shù)污染)不幸是，這些現(xiàn)象是最普通，也是最難調(diào)查。假如這種現(xiàn)象在屢次試驗中重復出現(xiàn)，可能說明這個工藝存在“環(huán)境噪聲”，所以需要根本辦法（如更衣/著裝、消毒劑和氣流模式改變)59無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第59頁主題6：培養(yǎng)基灌裝驗證關鍵點分析60無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第60頁培養(yǎng)基灌封后生產(chǎn)培養(yǎng)基灌封后能夠進行生產(chǎn)，但要等培養(yǎng)基灌封合格后產(chǎn)品才能放行（產(chǎn)品有報廢風險）。無效培養(yǎng)基灌封后能夠進行生產(chǎn)，但所生產(chǎn)批次要在成功培養(yǎng)基灌封后方可放行。培養(yǎng)基灌封失敗生產(chǎn)線不能用來生產(chǎn)，依據(jù)調(diào)查結(jié)果決定培養(yǎng)基灌封次數(shù)和數(shù)量，培養(yǎng)基灌封合格后，才能生產(chǎn)。61無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第61頁討論：最差條件WorstCase最差條件高于或低于正常范圍條件程度，與正常生產(chǎn)條件相比最有可能造成工藝或生產(chǎn)失敗條件。注意假如一些做法會帶來污染風險，則不允許用培養(yǎng)基灌封結(jié)果為它不合理進行辯護62無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第62頁最差條件設計（1）儲存時間Holdingtime灌封設備、灌封部件、儲罐、無菌物料、藥液在實際灌封前能夠放置最長時間1.灌封設備、灌封部件、儲罐、無菌物料需要再滅菌（除菌）時間間隔Worstcase:用超出保留時間灌封設備、灌封部件、儲罐、無菌物料參加培養(yǎng)基灌封2.產(chǎn)品從無菌過濾到灌封加塞完成所需要時間Worstcase：無菌過濾后存放在儲罐內(nèi)培養(yǎng)基模擬實際生產(chǎn)時產(chǎn)品最大儲存時間后再灌封產(chǎn)品在灌裝后儲存時間應在培養(yǎng)基灌封中驗證63無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第63頁最差條件設計（2）灌封連續(xù)時間Durationofruns最保守設計：在培養(yǎng)基灌封試驗中，模擬用時最長瓶子滿批量生產(chǎn)所需要時間，其中包含正常干擾時間（換班、設備維修）。其它設計：1.在生產(chǎn)完成后接著進行培養(yǎng)基灌封試驗2.為了降低灌封瓶數(shù)，在每批試驗剛開始及結(jié)束前均灌裝培養(yǎng)基，中間空運行灌封機以到達所需要時間在任何情況下模擬了與實際生產(chǎn)不相同情況，都要有統(tǒng)計，并解釋原因在正常生產(chǎn)過程中所需最長時間，包含可能發(fā)生事件，人員換班等，應給予模擬64無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第64頁最差條件設計（3）灌封數(shù)量灌封數(shù)量沒必要總是滿批量通例：小批量，最少要滿批量大批量，普通最少5000瓶在模擬無菌生產(chǎn)時間時會超出5000瓶65無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講座第65頁最差條件設計（4）灌封速度與瓶子規(guī)格灌封速度和瓶子規(guī)格關系最慢速度，最大瓶子規(guī)格最小瓶子規(guī)格，最快速度66無菌工藝驗證培養(yǎng)基灌封試驗專家講