醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑臨床前藥效學與安全性研究技術(shù)指南

醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑臨床前藥效學與安全性研究技術(shù)指南臨床前安全性與有效性研究是醫(yī)療機構(gòu)制劑進入臨床研究的重要環(huán)節(jié)之一。根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊管理辦法》（試行），參照《藥品注冊管理辦法》及國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的相關(guān)藥物研究技術(shù)指導原則，結(jié)合醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑的特點，特制定醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑臨床前藥效學與安全性研究技術(shù)指南。其目的是保障醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑安全、有效；指導規(guī)范醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑的研制；為醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑評價提供明確統(tǒng)一的技術(shù)指南。申請醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑，應當進行相應的臨床前藥效學與安全性研究，報送主要藥效學、急性毒性、長期毒性資料（含試驗資料及文獻資料）。因醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑均是我國上市化藥活性成分的制劑，故能提供文獻資料支持的可報送相應的文獻資料，不能提供文獻資料支持的，報送相應的試驗資料。一、一般要求（一）實驗管理根據(jù)《中華人民共和國藥品管理法》，藥物臨床前毒性試驗必須執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》。（二）研究機構(gòu)條件研究機構(gòu)必須是已在國內(nèi)外相關(guān)機構(gòu)注冊（或備案）、從事藥品安全性、有效性評價的具有法人資格的機構(gòu)。單位應具有相關(guān)研究領(lǐng)域的設備和相應設施。（三）研究人員資質(zhì)所有參加研究的人員必須接受過相關(guān)領(lǐng)域的正規(guī)訓練，其項目負責人必須是相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域的副高職稱及以上的人員。（四）試驗樣品/對照藥物要求臨床前藥效學與安全性研究試驗所用樣品，應當采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床質(zhì)量標準申報要求的樣品，并注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進行試驗。應提供所用溶媒和/或輔料的批號、規(guī)格、生產(chǎn)廠家。對照藥物原則上應采用已上市的、適應癥相同或類似且療效公認的藥物。（五）試驗設計試驗設計應符合隨機、對照、重復的原則。（六）具體問題具體分析醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑情況復雜，本文所提及的內(nèi)容不可能涵蓋臨床前安全性與有效性研究的全部實際情況，在進行研究時，應遵循“具體問題具體分析”的原則。二、不同類型制劑的研究技術(shù)要求醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑的臨床前藥效學與安全性研究內(nèi)容應根據(jù)申報品種的立題依據(jù)、臨床意義和定位、處方來源、使用歷史、有效性與安全性等背景資料進行綜合考慮。研究內(nèi)容的應該以能夠科學、合理、充分地評價制劑的臨床前有效性與安全性為原則。在具體進行試驗時可按以下要求進行。（一）減免條件及范圍1、已有同品種取得制劑批準文號的化藥制劑，可免報藥效學、急性毒性、長期毒性資料。2、醫(yī)療機構(gòu)化藥制劑，可提供文獻資料支持的，報送相應的文獻資料。（二）口服制劑1、單一成分制劑（1）藥效學研究對于單一成分制劑，如擬申報新的臨床適應癥，但未改變原用藥途徑、輔料或用藥劑量與用藥周期時，應提供藥效學試驗資料或文獻資料以支持新增的臨床適應癥。對于不改變臨床適應癥，但改變了給藥途徑或吸收部位、輔料等對藥物的生物利用度有明顯影響的，或者改變用藥劑量與用藥周期時，應提供藥效學試驗資料或文獻資料。（2）毒理學研究對于單一成分制劑，在不改變用藥途徑或吸收部位、用藥劑量與用藥周期，也不用于特殊人群（包括嬰幼兒、兒童、妊娠婦女）時，可報送相應的文獻資料。對于改變用藥途徑或吸收部位、用藥劑量、用藥周期或輔料等可能增加用藥安全風險的情況時，應提交毒性試驗資料或文獻資料。臨床使用人群為特殊人群（包括嬰幼兒、兒童、妊娠婦女）時，還應提交其他相關(guān)的安全性研究試驗資料和生殖毒性試驗資料或文獻資料。2、復方制劑（1）藥效學研究對于復方制劑，應進行相應的藥效學研究或提供上市復方制劑的相關(guān)文獻資料。研究內(nèi)容包括組方篩選、藥效學研究、主要藥效學研究的拆方試驗等，以支持制劑的臨床前有效性。（2）毒理學研究對于復方制劑，應該進行相關(guān)的毒理學研究或提供上市復方制劑的相關(guān)文獻資料。研究內(nèi)容包括急性毒性試驗、長期毒性試驗，必要時還需進行生殖毒性試驗、藥物相互作用和其他相關(guān)的安全性研究試驗。對于改變用藥劑量、給藥周期、輔料、適用人群等可能增加用藥安全風險的情況下，應提交長期毒性試驗資料。必要時還應提交生殖毒性研究資料和其他相關(guān)的安全性研究、藥物相互作用研究資料。（三）外用制劑一般應進行皮膚或黏膜的刺激性試驗與皮膚過敏性試驗。對于可能應用于破損皮膚或破損粘膜的制劑，還應進行破損皮膚或粘膜的單次或多次刺激性試驗。皮膚過敏試驗可采用豚鼠Buehler（BT）等試驗，以預測受試制劑潛在的過敏性。1、單一成分制劑（1）藥效學研究對于單一成分制劑，如擬申報新的臨床適應癥，但不改變原給藥途徑、輔料或用藥劑量與用藥周期時，應提供藥效學試驗資料或文獻資料以支持新增的臨床適應癥。對于改變給藥途徑、用藥部位或用藥部位面積、改變輔料等對藥物的透皮吸收、生物利用度有影響情況下，應提供藥效學試驗資料或文獻資料。（2）毒理學研究對于單一成分制劑，在不改變用藥途徑或吸收部位、不增加用藥劑量與用藥周期，可以只進行急性毒性試驗、皮膚或黏膜的刺激性試驗、皮膚過敏性試驗。對于改變用藥劑量、給藥周期、輔料、用藥途徑或吸收部位、使用人群等可能增加用藥安全風險時，應進行長期毒性試驗研究，必要時還應進行生殖毒性試驗研究。2、復方制劑（1）藥效學研究對于復方制劑，應該進行相應的藥效學研究。研究內(nèi)容包括組方篩選，藥效學研究及主要藥效學研究的拆方試驗等，以支持復方制劑的臨床前有效性。對于在已有上市藥品成分的基礎上研制的復方制劑，在不改變用藥途徑或吸收部位、輔料、用藥劑量或用藥周期等情況下，需要提交原批準上市復方制劑的相關(guān)文獻資料。（2）毒理學研究對于復方制劑，應該進行相關(guān)的毒理學研究。研究內(nèi)容包括急性毒性試驗、長期毒性試驗、皮膚或黏膜的刺激性試驗及皮膚過敏性試驗等。必要時還需進行生殖毒性試驗。對于復方制劑，在不改變用藥途徑或吸收部位、輔料、用藥劑量與用藥周期、使用人群等情況下，可以不進行長期毒性試驗，需進行急性毒性試驗、皮膚或黏膜的刺激性試驗與皮膚過敏性試驗。對于改變用藥劑量、給藥周期、輔料或使用人群等可能增加用藥安全風險時，應提交長期毒性試驗資料。必要時還應提交生殖毒性試驗資料。（四）注射劑申報醫(yī)療機構(gòu)化藥注射劑品種，參照新藥的注射劑相關(guān)研究技術(shù)要求進行試驗研究，提供試驗資料及文獻資料。三、基本內(nèi)容（一）藥效學預測藥物療效的重要手段就是圍繞其擬定的臨床適應癥展開系列藥效學評價。藥效學評價的方法應該遵照公認的或經(jīng)驗證后的方法、模型。根據(jù)藥效學研究結(jié)果判定藥物的作用強弱及主要作用特點，為臨床應用提供科學參考。1、實驗動物大鼠、小鼠應為清潔級以上的實驗動物，兔及豚鼠等動物應為普通級及以上等級動物。提供單位必須是已經(jīng)取得相應實驗動物生產(chǎn)合格證的單位。2、試驗環(huán)境應與實驗動物級別相應的實驗環(huán)境。3、動物模型藥效學評價盡量采用整體動物實驗，盡量采用與臨床適應癥相似或相近的成熟的疾病模型。根據(jù)藥物作用特點選擇相應的動物模型，鼓勵創(chuàng)新，但應有相應的試驗數(shù)據(jù)支持。應圍繞制劑的臨床適應癥選擇最具代表性的2個（含2個）以上動物模型，對制劑的藥效進行評價。4、組別設置至少應設三個劑量組，同時還應設空白溶劑組以及已證明模型成功的陽性藥物組。必要時需設正常對照組。5、檢測指標選擇檢測指標應與其臨床適應癥相匹配，且所檢測的指標應能進行定量或半定量。6、統(tǒng)計學處理所有結(jié)果均應選擇適宜的統(tǒng)計學方法進行分析，并用合適的用語進行描述。7、結(jié)果表述應選擇合適的圖、表進行表示，病理觀察應有相應的病理照片佐證。8、討論對結(jié)論應有簡略的討論，簡要說明檢測指標與疾病的關(guān)系，初步闡明藥物的作用特點。（二）臨床前安全性研究化藥制劑臨床前安全性研究應根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的相關(guān)藥物研究技術(shù)指導原則，遵循《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》。1、急性毒性試驗急性毒性試驗是指動物在24小時內(nèi)單次或多次給予受試藥后，一定時間內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應及死亡情況。其主要目的可以概括為以下五個方面：了解受試藥急性毒性的強度、為藥效學研究提供劑量參考、為臨床毒副反應的監(jiān)測及解救提供參考依據(jù)、為長期毒性、蓄積毒性試驗選擇劑量提供依據(jù)以及用于質(zhì)量控制等。急性毒性試驗處在藥物毒理研究的早期階段，對闡明藥物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義。（1）實驗動物一般采用1～2種種屬的實驗動物進行，推薦使用小鼠或大鼠，雌雄各半，如臨床為單性別用藥，則可采用相對應的單一性別的動物。對于所用的動物數(shù)，應根據(jù)動物的種屬和研究目的來確定。動物數(shù)應符合試驗方法及其結(jié)果分析評價的需要。動物應符合國家有關(guān)規(guī)定的等級要求，來源、品系、遺傳背景清楚，并具有實驗動物質(zhì)量合格證。通常采用健康成年動物進行試驗。如果受試物擬用于兒童，建議考慮采用幼年動物。動物初始體重不應超過或低于平均體重的20%。（2）實驗環(huán)境應在與實驗動物相應的試驗環(huán)境下進行。（3）試驗分組根據(jù)所選用急性毒性試驗的方法，合理進行實驗動物的分組。一般情況下，除設受試物的不同劑量組外，需要設立空白對照組和／或溶媒對照組。（4）給藥途徑一般應與擬臨床給藥途徑一致，如不采用擬臨床途徑給藥，必須充分說明理由。經(jīng)口給藥前應禁食不禁水16小時。（5）觀察期限一般為14天，如果毒性反應出現(xiàn)較慢，應適當XX觀察時間，如觀察時間不足14天，應充分說明理由。觀察的間隔和頻率應適當，以便能觀察到毒性反應出現(xiàn)的時間及其恢復時間、動物死亡時間等。（6）觀察指標應測定LD50或最大耐受量。觀察的指標包括一般指標（如動物外觀、行為、對刺激的反應、分泌物、排泄物等）、動物死亡情況（死亡時間、瀕死前反應等）、動物體重變化（給藥前、試驗結(jié)束處死動物前各稱重一次，觀察期間可多次稱重）等。記錄所有的死亡情況、出現(xiàn)的癥狀，以及癥狀起始的時間、嚴重程度、持續(xù)時間等。對瀕死及死亡動物應及時進行大體解剖，其他動物在觀察期結(jié)束后進行大體解剖，當發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時，則對改變的器官進行組織病理學檢查。（7）結(jié)果處理和分析根據(jù)所觀察到的各種反應出現(xiàn)的時間、嚴重程度、持續(xù)時間等，分析各種反應在不同劑量時的發(fā)生率、嚴重程度。根據(jù)觀察結(jié)果歸納分析，判斷每種反應的劑量-反應及時間-反應關(guān)系、各種反應可能涉及的組織、器官或系統(tǒng)等。根據(jù)不同劑量組各種毒性反應及發(fā)生率、動物死亡情況等，確定動物對受試物的毒性反應的性質(zhì)與強度。說明所使用的計算方法和統(tǒng)計學方法，提供所選用方法合理性的依據(jù)。根據(jù)大體解剖中肉眼可見的病變和組織病理學檢查的結(jié)果，初步判斷可能的毒性靶器官。如組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)有異常變化，應附有相應的組織病理學照片。組織病理學檢查報告應經(jīng)檢查者簽名和病理檢查單位蓋章。應根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，提示在其他安全性試驗、臨床試驗、質(zhì)量控制方面應注意的問題；同時，結(jié)合其他安全性試驗、有效性試驗結(jié)果權(quán)衡利弊，分析受試物的開發(fā)前景。2、長期毒性試驗長期毒性試驗是重復給藥的毒性試驗的總稱，描述動物重復接受受試物后的毒性特征，它是非臨床安全性評價的重要內(nèi)容。通過長期毒性試驗可以達到以下目的：預測受試物可能引起的臨床不良反應，包括不良反應的性質(zhì)、程度、劑量-反應和時間-反應關(guān)系、可逆性等；推測受試物重復給藥的臨床毒性靶器官或靶組織；預測臨床試驗的起始劑量和重復用藥的安全劑量范圍；提示臨床試驗中需重點監(jiān)測的指標；為臨床試驗中的解毒或解救措施提供參考信息。長期毒性試驗的結(jié)果應該力求與其他藥理毒理研究結(jié)果互為印證、說明和補充。（1）實驗環(huán)境實驗應在與實驗動物相應的環(huán)境中進行。（2）實驗動物推薦長期毒性試驗采用嚙齒類動物如大鼠，必要時采用非嚙齒類動物如犬，所用動物應符合國家有關(guān)藥物非臨床安全性研究的要求；長期毒性試驗一般選擇健康、體重均勻的動物，雌雄各半。當臨床擬用于單性別時，可采用相應性別的動物；應根據(jù)研究期限的長短和受試物的使用人群范圍確定動物的年齡。一般情況下，大鼠為6～9周齡；每組動物的數(shù)量應能夠滿足試驗結(jié)果的分析和評價的需要。一般情況下，大鼠每組雌、雄各10～30只。（3）給藥途徑原則上應與臨床擬用藥途徑相同。如選擇其他的給藥途徑，應說明理由。（4）給藥頻率原則上應每天給藥，且每天給藥時間相同。試驗周期長（3個月或以上）者，也可采取每周給藥6天。特殊類型的受試物由于其毒性特點和臨床給藥方案等原因，應根據(jù)具體藥物的特點設計給藥頻率。（5）給藥期限長期毒性試驗給藥期限的長短，通常與擬定的臨床療程長短、臨床適應癥、用藥人群相關(guān)，應充分考慮預期臨床的實際療程。當受試物預期會長期使用，或用于反復發(fā)作性疾病等而需經(jīng)常反復給藥時，應進行嚙齒類動物的長期毒性試驗，給藥周期應為臨床擬用藥周期的4倍或以上。當臨床適應癥有若干項的，應按照臨床最長療程的臨床適應癥來確定長期毒性試驗的給藥期限。如臨床給藥需采用多個療程，療程之間間隔時間不足以使受試物對機體組織器官造成的損害得以恢復，則需按多個療程的時間之和作為參照的臨床療程；如療程間隔時間足以使受試物對機體組織器官造成的損害得以恢復，則可按單個療程的時間作為參照的臨床療程。（6）給藥劑量一般情況下，至少應設3個劑量組和溶媒或賦形劑對照組，必要時還需設立空白對照組和/或陽性對照組。低劑量組原則上應高于動物藥效學試驗的等效劑量或預期的臨床治療劑量。高劑量組原則上應使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應，甚至可引起少量動物死亡。在高、低劑量之間至少應再設一個中劑量組。局部給藥時，應盡可能保證給藥劑量的準確性及與局部充分接觸的時間。（7）檢測指標應進行體重、攝食量、血液學、血液生化、電解質(zhì)、糞尿、臟器組織病理學等檢測。除上述必需的檢測指標外，應根據(jù)受試物的特點，針對性地增加相應的檢測指標。當所用動物為非嚙齒類動物時，應對各組所有動物的器官和組織進行組織病理學檢查。當所用動物為嚙齒類動物時，應對高劑量組和對照組的器官和組織進行組織病理學檢查，如果高劑量組出現(xiàn)組織病理學變化時，更低劑量組也應進行組織病理學檢查以確定劑量-反應關(guān)系。若在尸檢時發(fā)現(xiàn)器官和組織有肉眼可見的病理變化時，應對此臟器或組織進行詳細的組織病理學檢查。應注意對臟器和組織的標本取材保存。高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時，應對保存的更低劑量組的相應臟器、組織標本進行檢查。如發(fā)現(xiàn)有異常變化，應附有相應的組織病理學照片。組織病理學檢查報告應經(jīng)檢查者簽名和病理檢查單位蓋章。病理指標應盡量檢測多臟器，但如有合理的理由說明所申報的制劑有一定的安全性，所檢查的臟器和組織可減少為：心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸、大腸、垂體、脊髓、骨髓、淋巴結(jié)、膀胱、睪丸、附睪、子宮、卵巢、胸腺、腎上腺及給藥局部組織等。（8）觀察指標的時間和次數(shù)應根據(jù)試驗期限的長短和受試物的特點而確定試驗期間觀察指標的時間和次數(shù)，原則上應盡早、及時發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)的毒性反應。試驗前，嚙齒類動物至少應進行適應性觀察5天，應對實驗動物進行外觀體征、行為活動、攝食量和體重檢查，此外，實驗動物相關(guān)指標的歷史數(shù)據(jù)在長期毒性試驗中也具有重要的參考意義。試驗期間，一般狀況和征狀的觀察，應每天觀察一次，飼料消耗和體重應每周記錄一次。大鼠體重應雌雄分開進行計算。試驗結(jié)束時應進行一次全面的檢測。當給藥期限較長時，應根據(jù)受試物的特點選擇合適的時間進行中期階段性的檢測。長期毒性試驗應在給藥結(jié)束時留存部分動物進行恢復期觀察，以了解毒性反應的可逆程度和可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應。在試驗期間，對瀕死或死亡動物應及時檢查并分析原因。（9）結(jié)果及分析試驗報告應全面客觀反映整個試驗過程收集的原始資料和信息，應詳細描述毒性的主要表現(xiàn)、大體解剖檢查和/或病理組織學檢查結(jié)果等，并說明數(shù)據(jù)處理的統(tǒng)計學方法。分析長期毒性試驗結(jié)果的目的是判斷動物是否發(fā)生毒性反應，描述毒性反應的性質(zhì)和程度（包括毒性起始時間、程度、持續(xù)時間以及可逆性等）和靶器官，確定安全范圍，并探討可能的毒性作用機制。應對所獲取的數(shù)據(jù)進行全面和科學的分析，對在正常范圍以外的各實測值應在試驗結(jié)果中詳細列出，對異常數(shù)據(jù)予以合理的分析。根據(jù)長期毒性試驗結(jié)果，分析討論需在臨床試驗中注意的問題。如果大鼠試驗結(jié)果顯示藥物具有明顯毒性作用，應提供受試藥物對犬的長期毒性試驗結(jié)果。3、皮膚用藥急性毒性試驗皮膚用藥急性毒性試驗是指觀察動物完整皮膚及破損皮膚短期內(nèi)接觸受試物所產(chǎn)生的毒性反應。（1）實驗動物一般選用兔、豚鼠以及大鼠，原則上，動物應雌雄各半。家兔體重2kg、豚鼠300g，大鼠200g左右為宜。每組動物的數(shù)量：兔4只及以上，豚鼠或大鼠應至少為10只。（2）脫毛面積脫毛面積應為動物體表面積的10%左右。（3）給藥劑量及組別一般情況下，設3個劑量組、溶媒或/和賦形劑對照組，若受試物劑量超過有效濃度20倍以上，仍未出現(xiàn)異常反應或死亡，可只設一個高劑量組。（4）受試物固定受試物均勻涂布于動物背部脫毛區(qū)，破損皮膚則在脫毛區(qū)劃破皮膚后再涂受試物，并用適宜方法固定。局部給藥時，應盡可能保證給藥劑量的準確性及與局部充分接觸的時間。敷受試物24小時后，可用溫水或適當溶媒去除殘留受試物或賦形劑。（5）觀察時間逐日連續(xù)觀察14日。（6）觀察指標除了參照急性毒性的一般觀察指標外，需要觀察皮膚給藥的局部反應。必要時提供相應的組織病理學照片。（7）結(jié)果及分析試驗報告應全面客觀反映整個試驗過程收集的原始資料和信息，應詳細描述毒性的主要表現(xiàn)、大體解剖檢查和/或病理組織學檢查結(jié)果等，并說明數(shù)據(jù)處理的統(tǒng)計學方法，如用計算機處理數(shù)據(jù)，應說明所用軟件。結(jié)果應以清楚、準確的方式來表示。實驗結(jié)果的判斷應與對照組進行比較判斷。4、皮膚用藥長期毒性試驗皮膚用藥長期毒性試驗是指觀察動物皮膚長期接觸藥物后，對皮膚組織或經(jīng)皮膚滲透對機體產(chǎn)生的毒性反應和反應的可逆程度，尋找毒性靶器官。（1）實驗動物一般選用兔、豚鼠以及大鼠，原則上動物應雌雄各半。家兔體重2kg、豚鼠300g，大鼠200g左右為宜。（2）每組動物的數(shù)量家兔每組6只，豚鼠大鼠每組10只。（3）脫毛面積脫毛面積應為動物體表面積的10%左右。（4）給藥劑量及組別一般情況下，設3個劑量組、溶媒或/和賦形劑對照組；若受試物劑量超過有效濃度20倍以上，仍未出現(xiàn)異常反應或死亡，則只設一個高劑量組。（5）受試物固定受試物均勻涂布于動物背部脫毛區(qū)，破損皮膚則在脫毛區(qū)劃破皮膚后再涂受試物，并用適宜方法固定。每日一次，每次至少接觸6小時。（6）給藥時間參照長期毒性試驗的一般原則。（7）觀察指標除增加給藥部位皮膚及其組織乃至全身皮膚變化和皮膚病理學檢查外，其余指標參照口服長期毒性試驗的一般原則。（8）結(jié)果及分析全身毒性反應的結(jié)果分析應參照口服長期毒性試驗的一般原則，還應評價給藥局部及其周圍組織的毒性反應。5、皮膚刺激試驗皮膚刺激試驗是指觀察受試物短期接觸動物皮膚后，在規(guī)定時間內(nèi)對動物皮膚所產(chǎn)生的刺激反應及其他毒性反應。（1）實驗動物首選家兔，每組動物數(shù)4只以上，一般雌、雄各半，也可選用其他種屬的動物如豚鼠、小型豬等。小型豬每組4只以上，豚鼠每組10只以上。應設賦形劑對照，采用同體左右側(cè)自身對比法。試驗前24小時對給藥區(qū)（通常在背部）進行脫毛處理（可剪、剃或用適宜的脫毛劑）。去毛范圍左、右側(cè)各3cm×3cm。給藥前應檢查去毛皮膚是否因去毛而受損傷，有損傷的皮膚不宜進行試驗。進行破損皮膚的刺激性研究時，在用藥部位用砂紙磨或劃“井”字并以滲血為度。（2）給藥方法刺激試驗應觀察受試物對破損皮膚和完整皮膚的刺激作用。常在敷藥24小時后進行觀察、評分，皮膚刺激試驗除了設空白對照組、溶媒或賦形劑組外，藥物組應包括臨床用藥濃度組。一般取受試物0.5ml或0.5g直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定，貼敷時間至少4小時。貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水或無刺激性溶媒清潔給藥部位。多次給藥皮膚刺激性試驗應連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時間相同，貼敷期限一般不超過4周。（3）觀察指標重點觀察敷藥區(qū)皮膚的反應，如紅斑與水腫，并按相關(guān)皮膚刺激反應評分標準進行評分。必要時提供相應的組織病理學照片。（4）結(jié)果及分析根據(jù)評分判定受試物的刺激強度。6、皮膚過敏性試驗皮膚過敏性試驗是指觀察受試物多次接觸動物皮膚后，在規(guī)定時間內(nèi)對動物皮膚所產(chǎn)生的過敏反應及其他不良反應。（1）實驗動物一般選用豚鼠，雌雄各半。豚鼠250g左右為宜。每組動物的數(shù)量10只左右。過敏試驗動物脫毛面積為動物體表面積的10%左右。（2）給藥劑量及組別皮膚過敏試驗除了設空白對照組、溶媒或賦形劑對照組及藥物組外，還應設陽性藥物組。藥物劑量取決于所選擇的方法。在Buehler試驗（BT試驗）中，致敏劑量應當足夠高，以產(chǎn)生輕微的刺激性，激發(fā)劑量為不產(chǎn)生刺激性的最高劑量。在豚鼠最大化試驗（GPMT試驗）中，致敏劑量應足夠高，以產(chǎn)生輕－中度的皮膚刺激性且能很好地全身耐受，激發(fā)劑量為不產(chǎn)生刺激性的最高劑量。（3）觀察指標主要觀察敷藥區(qū)皮膚的反應，如紅斑與水腫等，并按相關(guān)標準進行評分。必要時提供相應的組織病理學照片。測定開始和結(jié)束時的動物體重。（4）結(jié)果及分析計算過敏反應發(fā)生率，判斷過敏反應發(fā)生程度，并根據(jù)評分判定受試物的致敏強度。7、眼刺激試驗眼刺激試驗是指觀察受試物對動物眼和粘膜的原發(fā)性刺激作用。（1）實驗動物一般首選兔，雌雄各半。家兔體重2～3kg，每組家兔的數(shù)量至少4只。（2）給藥方法一般設計一只眼給藥物，另一只眼作對照。給藥眼睛每只滴入0.05～0.1ml或涂敷0.1g受試物。給藥后使眼睛閉合10秒鐘左右，記錄給藥后6、24、48、72小時至7日內(nèi)眼的局部反應情況。觀察時應用熒光素鈉檢查角膜損害，用裂隙燈檢查角膜透明度和虹膜紋理改變。（3）給藥時間凡臨床用藥超過1周的受試物要進行多次給藥刺激試驗，每天給受試物的次數(shù)應與臨床用藥頻率相同，連續(xù)給藥在1周以上。（4）結(jié)果及分析按眼刺激反應分值標準，將每一個觀察時間每一動物的眼角膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應分值相加得總積分，將一組的積分總和除以動物數(shù)，即得最后分值。8、鼻腔給藥急性毒性試驗鼻腔給藥急性毒性試驗是指觀察受試物一次滴入或吸入后對動物所產(chǎn)生的毒性反應或死亡情況。（1）實驗動物選擇大鼠、豚鼠或兔，雌雄各半。大鼠、豚鼠體重250～300g，家兔體重2～3kg。每組動物的數(shù)量：兔4只，大鼠或豚鼠10只。（2）給藥劑量及組別一般應設計3個劑量組，同時還應設賦形劑組或空白對照組。若大劑量組超過預計臨床用量的50倍以上而未出現(xiàn)死亡情況時，可只需設一個高劑量組。如能測出LD50，則參照口服LD50測定方法進行。（3）給藥時間給予藥物后，盡量保證藥物接觸鼻腔的時間。（4）觀察指標除了參照急性毒性的一般觀察指標外，需要觀察鼻腔的局部反應。（5）結(jié)果及分析參照急性毒性實驗結(jié)果分析的一般原則。9、鼻腔給藥刺激性試驗鼻腔給藥刺激性試驗是指觀察受試物一次滴入或吸入后對動物所產(chǎn)生的刺激作用。（1）實驗動物選擇大鼠、豚鼠或兔，雌雄各半。大鼠、豚鼠體重250～300g，家兔體重2～3kg。每組動物的數(shù)量：兔3只，大鼠或豚鼠5只。（2）給藥劑量及組別一般應設計3個劑量組，同時還應設賦形劑或空白對照組。（3）給藥時間給予藥物后，盡量保證藥物接觸鼻腔時間。凡臨床用藥超過1周的受試物要進行多次給藥刺激試驗，連續(xù)給藥在1周以上。（4）觀察指標末次給藥后24小時處死動物，重點觀察給藥局部有無充血、水腫等現(xiàn)象，進行病理組織學檢查。（5）結(jié)果及分析與對照組進行比較判斷。10、口腔給藥刺激性試驗口腔給藥刺激性試驗是指觀察受試物一次滴入或吸入后對動物口腔黏膜所產(chǎn)生的刺激作用。（1）實驗動物首選金黃地鼠，也可選用家兔，雌雄各半。金黃地鼠體重250～300g，家兔體重2～3kg。每組動物的數(shù)量：兔5只，金黃地鼠10只。（2）給藥方法取金黃地鼠10只，采用左、右自身對照的方法，分為藥物組和溶媒組。用烏來糖腹腔注射麻醉后（800mg/kg.bw），先用生理鹽水清洗頰囊，再將重量為0.02g的消毒棉球注入1.5ml藥液，輕放于動物頰囊極低處，保持接觸4小時。（3）給藥時間給予藥物后，至少接觸4小時。凡臨床用藥超過1周的受試物要進行多次給藥刺激試驗，連續(xù)給藥在1周以上。（4）觀察指標在每次給藥前及取出棉球后肉眼觀察頰囊，按表1判定動物每一觀察期頰囊的刺激反應情況；于末次取出棉球后24h處死動物，取局部給藥組織進行病理組織學檢查，按表2病理反應評分標準計算每只動物病理反應分值，再按表3進行病理反應分級。表1口腔黏膜臨床表現(xiàn)分級表現(xiàn)反應無紅斑無明顯紅斑輕度中度紅斑中度重度紅斑（深紅）～輕度疤痕形成（包括糜爛及潰瘍）重度表2口腔黏膜組織病理反應評分標準反應說明評分上皮正常0細胞變性或變扁平1化生2局部糜爛3廣泛糜爛4白細胞浸潤（每個高倍視野）無0極小﹤25個1輕度26～50個2中度51～100個3重度﹥100個4血管充血無0極少1輕度2中度3重度伴有血管破裂4水腫無0極少1輕度2中度3重度4表3病理反應分級反應評分等級0～4無