三三酶化學修飾

三三酶化學修飾第1頁/共46頁1）、如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性

修飾劑分子存在多個反應基團，可與酶形成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。2）、如何保護酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第2頁/共46頁3）、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：A.大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。B.酶分子上許多敏感基團交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第3頁/共46頁4）、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境A.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除

“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合B.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。第4頁/共46頁三、原理

利用化學修飾劑所具有的各種基團的特性，直接或間接地經(jīng)過一定的活化過程與酶分子的某種氨基酸殘基發(fā)生化學反應，從而對酶分子的結(jié)構(gòu)進行改造。第5頁/共46頁四、修飾的一般程序修飾反應酸化稀釋陽離子交換洗滌過濾干燥第6頁/共46頁五、化學修飾方法1、側(cè)鏈基團的化學修飾定義：通過選擇性的試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團發(fā)生化學反應。

作用：探測酶分子活性部位的結(jié)構(gòu)，推測被修飾氨基酸殘基在酶分子中的功能。側(cè)鏈基團，組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團修飾劑：采用的各種小分子化合物。

20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。第7頁/共46頁極性氨基酸

1）無電荷的極性氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S),蘇氨酸(Threonine,Thr,T),

酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),

天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),

谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)2）.帶正電荷的極性氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),

組氨酸(Histidine,His,H)3）帶負電荷的極性氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),

谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)第8頁/共46頁第9頁/共46頁1）、-NH2的化學修飾(主要用于賴氨酸的修飾）第10頁/共46頁2）、-COOH的化學修飾（主要用于谷氨酸和天冬氨酸）第11頁/共46頁3）、-SH的化學修飾（半光氨酸）第12頁/共46頁4）、咪唑基的修飾（組氨酸）第13頁/共46頁5）、胍基的修飾（精氨酸）第14頁/共46頁6）、吲哚基的化學修飾（色氨酸）第15頁/共46頁7）、（酚）羥基殘基的修飾（酪氨酸，絲氨酸,蘇氨酸）第16頁/共46頁8）、脂肪族氨基酸殘基的修飾第17頁/共46頁8）、甲硫基的修飾（甲硫氨酸）第18頁/共46頁9）、二硫鍵的修飾第19頁/共46頁2、酶分子表面的化學修飾

利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。水溶性大分子：ＰＥＧ及其衍生物：是線性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性。右旋糖酐及其衍生物：右旋糖苷是由α—葡萄糖通過α—1，6—糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。糖肽：糖肽是蛋白酶水解人纖維蛋白或Y一球蛋白所得到的產(chǎn)物。其分子上具有游離氨基，活化后與酶分子上氨基反應，從而可修飾酶。其他天然大分子（肝素、血清白蛋白）其它合成大分子多聚物：聚N—乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇（PVA）聚丙烯酸(PAA)，聚順丁烯二酸酐，聚氨基酸等。第20頁/共46頁１）ＰＥＧ的修飾（常采用單甲氧基MPEG的衍生物）第21頁/共46頁第22頁/共46頁２）、右旋糖酐（可作代血漿用）及右旋糖酐硫酸酯的修飾第23頁/共46頁第24頁/共46頁３）、糖肽（水解纖維蛋白或γ-球蛋白而獲得）第25頁/共46頁４）、其他大分子（肝素、血清白蛋白）肝素，是一種含硫酸酯的粘多糖，由氨基葡萄糖和糖醛酸構(gòu)成。第26頁/共46頁第27頁/共46頁白蛋白第28頁/共46頁3、親和標記

前面介紹的修飾方法，其修飾劑對特定殘基的專一性修飾較差，往往會跟多個同類殘基發(fā)生反應。為了克服這一缺陷，人們開始使用親和性標記。它利用酶和底物的親和性，使用與酶底物或配體結(jié)構(gòu)類似的修飾劑，對酶活性部位上的氨基酸殘基進行共價標記。（依據(jù)抗原-抗體的親和反應而設(shè)計的一種修飾方法，具有特異性修飾功能。）第29頁/共46頁4、肽鏈的有限水解

酶原的激活，就是一種肽鏈的有限水解，即肽鏈的水解在限定的肽鍵上進行，酶分子的活性中心沒有受到損傷，只是激活了酶的活性或降低了酶分子的抗原性。第30頁/共46頁5、氨基酸置換修飾氨基酸置換修飾

將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。通過兩個途徑實現(xiàn)：化學修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少；蛋白質(zhì)工程：利用基因操縱技術(shù)。第31頁/共46頁6、金屬離子置換修飾

改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。第32頁/共46頁六、酶經(jīng)修飾后的性質(zhì)變化

提高了酶穩(wěn)定性，改善反應條件及延長使用壽命，改變了最適pH、Km、抑制常數(shù)、減少或消除了抗原性，甚至使酶分子具備對某些組織和細胞的親和力和穿透性。第33頁/共46頁1、酶穩(wěn)定性第34頁/共46頁2、抗原性第35頁/共46頁3、對各類失活因子的抵抗力第36頁/共46頁4、半衰期及酶活殘留率第37頁/共46頁5、pH第38頁/共46頁6、Km第39頁/共46頁七、酶化學修飾的應用1、酶結(jié)構(gòu)與功能的研究（小分子對酶側(cè)鏈基團的化學修飾）1)、非專一性化學修飾用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團作用：

A、若酶活性不變——該基團可能不是酶的必需基團

B、若酶活性降低或喪失——該基團可能是酶的必需基團，但不能確定化學試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團結(jié)合。第40頁/共46頁2）、專一性化學修飾第41頁/共46頁YYYX-YYYX位點專一性修飾：底物類似物第42頁/共46頁活性中心基團的鑒定標準①失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。②S或可逆抑制劑有保護作用（活性中心）：先加S或競Ⅰ加共價修飾劑透析除去S或競Ⅰ活性不喪失③差別標記：底物或抑制劑存在活性基團不與修飾劑作用去除底物或抑制劑原來被保護的基團帶同位素標記化學修飾含同位素標記的同樣試劑第43頁/共46頁2、醫(yī)藥（大分子對酶分子表面的化學修飾）

優(yōu)點：PEG分子與酶蛋白連接后可以在蛋白質(zhì)表面形成保護層，同時由于PEG分子特有的柔性和線性，能夠很好地掩蓋蛋白質(zhì)的抗原決定族，從而延長修飾酶在體內(nèi)的作用時間和藥效，改變組織分布。此外白蛋白，肝素和右旋糖苷等均具有很好的生物相容性。可消除酶的抗