基因工程DNA序列分析

基因工程DNA序列分析第1頁(yè)/共26頁(yè)第2頁(yè)/共26頁(yè)第3頁(yè)/共26頁(yè)DNA測(cè)序方法：Maxam-Gilbert化學(xué)降解法雙脫氧鏈終止法（Sanger酶學(xué)法）

第4頁(yè)/共26頁(yè)第5頁(yè)/共26頁(yè)第一節(jié)Maxam-Gilbert化學(xué)降解法1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的測(cè)定方法，由于該方法是用特定化學(xué)試劑修飾不同堿基，并在相應(yīng)堿基處切斷DNA片段而進(jìn)行系列分析的，故稱之為Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。第6頁(yè)/共26頁(yè)一、基本原理

將待測(cè)DNA片段的5’端磷酸基團(tuán)作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法對(duì)特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列5’端被標(biāo)記的長(zhǎng)度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過并列點(diǎn)樣的方式用凝膠電泳進(jìn)行分離，再經(jīng)放射自顯影，即可讀出目的DNA的堿基序列。直接或間接特異性識(shí)別4種堿基生成其始于固定起點(diǎn)和終止于特定堿基的一組核苷酸片段特定化學(xué)試劑可對(duì)堿基進(jìn)行特異性修飾在修飾堿基處（5’或3’）打斷磷酸二酯鍵第7頁(yè)/共26頁(yè)第8頁(yè)/共26頁(yè)二、化學(xué)降解測(cè)序法的基本步驟

對(duì)待測(cè)DNA片段的5’端磷酸基團(tuán)作放射性標(biāo)記；用化學(xué)修飾劑修飾特定堿基；凝膠電泳分離和放射自顯影及讀序。第9頁(yè)/共26頁(yè)第10頁(yè)/共26頁(yè)第11頁(yè)/共26頁(yè)第12頁(yè)/共26頁(yè)第二節(jié)Sanger雙脫氧鏈終止法一、基本原理雙脫氧核苷酸（ddNTP）分子的脫氧核糖的3’位置的羥基缺失，當(dāng)它與正常核苷酸混合在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系中時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，雖然它也能參與DNA合成，但由于其3’位置的羥基缺失，使其下面的核苷酸的5’磷酸基無法與之結(jié)合。也就是說，一旦雙脫氧核苷酸整和到正在合成的DNA鏈中，該股DNA的合成就到此終止。第13頁(yè)/共26頁(yè)以待測(cè)單鏈或雙鏈DNA為模板，使用能與DNA模板結(jié)合的一段寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA鏈。正常情況下的DNA聚合酶催化反應(yīng)在其反應(yīng)體系中包含4種脫氧核苷酸，合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈。當(dāng)向該反應(yīng)體系中加入一種雙脫氧核苷酸后，在DNA合成過程中ddNTP將與相應(yīng)的dNTP競(jìng)爭(zhēng)摻入到新合成的DNA互補(bǔ)鏈中。如果dNTP摻入其中，則DNA互補(bǔ)鏈將繼續(xù)延伸下去；而如果ddNTP摻入其中，DNA互補(bǔ)鏈則到此終止。第14頁(yè)/共26頁(yè)第15頁(yè)/共26頁(yè)第16頁(yè)/共26頁(yè)二、序列分析的基本步驟1、模板制備和引物設(shè)計(jì)

模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈DNA，必須保證足夠的濃度引物：18-22nt，55-60℃，盡量避免3個(gè)以上堿基重復(fù)，盡量減少發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的可能性。多數(shù)情況采用通用引物測(cè)序。第17頁(yè)/共26頁(yè)2、經(jīng)典測(cè)序方法的反應(yīng)步驟

模板變性退火標(biāo)記

摻入標(biāo)記：[α-32P]dATP、[α-33P]dATP、[α-35P]dATP

末端標(biāo)記：[γ-32P]rATP

延伸電泳分析和數(shù)據(jù)讀取第18頁(yè)/共26頁(yè)三、序列分析的工作模式

手動(dòng)測(cè)序缺點(diǎn)：工作強(qiáng)度大，操作人員要求技能嫻熟。測(cè)序長(zhǎng)度有限。第19頁(yè)/共26頁(yè)P(yáng)CR測(cè)序第20頁(yè)/共26頁(yè)

全自動(dòng)測(cè)序用4種不同的羅丹明熒光染料分別標(biāo)記4種雙脫氧核苷酸。第21頁(yè)/共26頁(yè)第22頁(yè)/共26頁(yè)第三節(jié)DNA片段序列測(cè)定的策略一次測(cè)序反應(yīng)一般可讀出500-800bp，若待測(cè)序的DNA片段較大，則需從多處不同的位置引導(dǎo)測(cè)序反應(yīng)。

通用引物指導(dǎo)未知序列的測(cè)定引物步移隨機(jī)克隆測(cè)序缺失克隆測(cè)序第23頁(yè)/共26頁(yè)第24頁(yè)/共26頁(yè)3.缺失克隆測(cè)序隨機(jī)克隆測(cè)序詳細(xì)過程：http://smcg.cifn.una