基因工程課時

基因工程課時第1頁/共66頁切接轉(zhuǎn)增檢基因工程內(nèi)容和步驟第2頁/共66頁基因克隆和DNA分析（第5版）

第一部分基因克隆和DNA分析的基本原理第1章為什么說基因克隆與DNA分析非常重要第2章基因克隆的載體——質(zhì)粒和噬菌體第3章從活細胞中純化DNA

第4章DNA純化后的利用第5章將DNA引入活細胞第6章大腸桿菌的克隆載體第7章真核生物的克隆載體第8章怎樣獲得特定基因的克隆第9章聚合酶鏈反應（PCR）

第二部分基因克隆和DNA分析在研究中的應用第10章基因的位置和結(jié)構(gòu)的研究第11章基因表達和功能的研究第12章基因組研究

第三部分基因克隆和DNA分析在生物技術(shù)中的應用第13章克隆基因的表達第14章基因克隆和DNA分析在醫(yī)學中的應用第15章基因克隆和DNA分析在農(nóng)業(yè)中的應用第16章基因克隆和DNA分析在法醫(yī)學和考古學中的應用第3頁/共66頁第4章DNA純化后的利用DNA操作酶DNA連接酶DNA限制性內(nèi)切酶第4頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍核酸酶（nuclease）連接酶（ligase）聚合酶（polymerase）修飾酶（modifyingenzyme）拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase）其它第5頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.1核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶定義：打斷DNA鏈中連接相鄰核苷酸的磷酸二酯鍵第6頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.1核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶分類：外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶從DNA分子的末端一個一個地切除核苷酸鏈在一個DNA分子內(nèi)部打開磷酸二酯鍵第7頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.1核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-Bal31Bal31：同時對DNA分子的雙鏈末端一個一個地切除核苷酸鏈越來越短單核苷酸第8頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.1核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-核酸外切酶Ⅲ核酸外切酶Ⅲ：可以從DNA雙鏈中一條鏈的3′末端一個一個地切除核苷酸鏈產(chǎn)物：單鏈DNA分子（不能作用于單鏈分子）第9頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.1核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-S1核酸酶S1核酸酶：催化單鏈DNA分子降解成為5′單核苷酸作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從此處切斷核酸分子第10頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.1核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-DNaseⅠDNaseⅠ（脫氧核糖核酸酶Ⅰ）

：打開DNA分子內(nèi)部任意的磷酸二酯鍵（包括單鏈和雙鏈）產(chǎn)物為單核苷酸與寡核苷酸或單核苷酸（可以用在RNA提取中去除DNA）第11頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.1核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶：能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶基因工程中主要工具酶-一把特殊的剪刀第12頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.2連接酶：將兩個核酸分子連接起來的酶DNA連接酶DNA連接酶（ligase）：在一條DNA鏈的3′末端具有一個游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5′-末端具有一個磷酸基團（-P）的情況下，能夠催化在2條DNA鏈之間形成的磷酸二酯鍵第13頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍缺口（nick）裂口（gap）第14頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.3聚合酶：復制核酸分子的酶DNA聚合酶DNA聚合酶：能夠合成一條與一直模板DNA或者RNA互補的新DNA雙鏈要素：模版和引物第15頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.3聚合酶：復制核酸分子的酶種類很多，基因工程中常用到四種（1）DNA聚合酶Ⅰ（大腸桿菌）DNA聚合酶Ⅰ：當DNA雙鏈分子中存在一個單鏈缺口時，DNA聚合酶與單鏈區(qū)域結(jié)合，合成一條新鏈，替換并降解原來存在的那段DNA具備DNA合成和水解雙重酶活性第16頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.3聚合酶：復制核酸分子的酶（2）Klenow片段（DNA聚合酶Ⅰ一部分）DNA聚合酶Ⅰ的合成酶活性和水解酶活性是由酶分子的不同部分控制，其中酶分子前段325個氨基酸具有水解酶活性，切掉這一部分后，剩下的部分則只具有聚合酶活性，剩下的DNA聚合酶Ⅰ片段稱為Klenow片段，在基因工程中可以用來補缺口第17頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.3聚合酶：復制核酸分子的酶（3）TaqDNA聚合酶（PCR）TaqDNA聚合酶是一種來源于嗜熱菌Thermusaquaticus的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，95℃孵育時的半衰期大于40分鐘第18頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.3聚合酶：復制核酸分子的酶（4）反轉(zhuǎn)錄酶（病毒，依賴于RNA的DNA聚合酶）反轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模版合成互補的DNA鏈（cDNA）第19頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.4修飾酶：去除或添加化學基團的酶（1）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）堿性磷酸酶：去除DNA分子5‘末端的磷酸基團第20頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍第21頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.4修飾酶：去除或添加化學基團的酶（2）多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）多核苷酸激酶：在DNA分子5‘游離末端添加磷酸基團（活性正好和堿性磷酸酶相反）第22頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.4修飾酶：去除或添加化學基團的酶（3）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：在DNA分子3‘末端添加一個或多個脫氧核苷酸構(gòu)建人工粘性末端，不需要模板第23頁/共66頁4.1DNA操作酶的范圍4.1.5拓撲異構(gòu)酶：向共價閉合環(huán)狀DNA中引入或消除雙螺旋的酶第24頁/共66頁第25頁/共66頁限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶II在特定的核苷酸序列處切割DNADNA分子中識別序列的出現(xiàn)頻率在實驗室條件下進行限制性酶切對限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進行分析DNA分子大小的估計4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶通過作圖標出一個DNA分子上的不同限制性位點平末端和黏末端第26頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶準確可重復第27頁/共66頁4.2.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶20世紀50年代宿主調(diào)控性限制第28頁/共66頁4.2.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第29頁/共66頁1970年H.O.

Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。WernerArber理論預見限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷HamiltonO.Smith得到第一個限制酶1978年Nobel生理或醫(yī)學獎4.2.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第30頁/共66頁目前為止，在細菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了1200多種限制性內(nèi)切酶，分為三類：

其識別位點與切割位點相距1000-5000bp，切割位點不表現(xiàn)嚴格的特異性；2條鏈上的斷裂位點相距70-75個核苷酸；

識別序列具有特異性，且序列為旋轉(zhuǎn)對稱性，切割位點位于限制性內(nèi)切酶識別序列之內(nèi)，限制性內(nèi)切酶的功能核甲基化酶的功能分開；是基因工程中常用的內(nèi)切酶；

由R、MS亞基共同組成，其中MS亞基具有位點識別和甲基化修飾的雙重功能；R亞基具有內(nèi)切酶活性。切割位點位于識別位點的一側(cè)若干堿基對處，無序列特異性，而只與識別位點的距離有關(guān)，從7-26bp不等。在與識別位點結(jié)合之后，修飾作用和限制作用取決于兩個亞基之間的競爭。限制性內(nèi)切酶的分類4.2.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第31頁/共66頁I和III型酶識別序列特點：

一般具有內(nèi)切酶和甲基化酶的活性，

識別或切割位點不恒定，

不具備用來做工具酶，II型酶識別序列特點：

均有嚴格的識別特定核苷酸的序列，

識別的核苷酸序列一般在4－8個堿基對大多數(shù)識別位點具有180度旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)形式4.2.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第32頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA第33頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA命名：400余種II類酶，鑒定的識別和切割位點有300多種，商品化100多種，DNA重組技術(shù)中常用的有20多種。其命名書寫規(guī)則：以生物體屬名的第一個大寫字母和種名的前2個小寫字母構(gòu)成酶的基本名稱；若酶在一個特殊菌株上發(fā)現(xiàn)，則將株名的第一個字母加在基本名稱之后；若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還用一個大寫字母表示這些非染色體的遺傳因子；酶最后的部分為羅馬字母，表明該生物發(fā)現(xiàn)此酶的先后順序。如HindIII表明在Heamophilusinfluenzaed菌株種發(fā)現(xiàn)的第3種酶；EcoRI表明在Escherichiacoli的抗藥性R質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個酶第34頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA第35頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNAII型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的1800旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列第36頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA回文結(jié)構(gòu)

如HindIII—AAGCTT—

—TTCGAA—HapII—CCGG—

—GGCC—Cfr13I—GGNCC—

—CCNGG—Eco81I—CCTNAGG—

—GGANTCC—NotI—GCGGCCGC—

—CGCCGGCG—第37頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.3平末端和黏末端第38頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.3平末端和黏末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPPstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端第39頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.3平末端和黏末端同尾酶：有些來源不同的酶盡管其識別的序列不同，但是其切割出的DNA片段是有相同的粘性末端。第40頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.4DNA分子中識別序列的出現(xiàn)頻率理論上：GATC每44=256個堿基

出現(xiàn)一次GGATCC每46=4096個堿基

出現(xiàn)一次實際上識別位點發(fā)生的頻率從要小一點（如識別6個堿基的BamHI，BglII，SalI）第41頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.4DNA分子中識別序列的出現(xiàn)頻率限制性酶切位點通常稱不會均勻分布于DNA分子中第42頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.5在實驗室條件下進行限制性酶切如何做一個酶切反應：（1）2ugDNA濃縮到125ug/ml（不高不低，純）16ul（2）

限制性內(nèi)切酶BglII（4U/ul）

一個酶單位（U）定義為一定溫度（通常為37度）下1小時內(nèi)切割1ugDNA所需要的酶量

2ugDNA需要2U即4U/ulX0.5ul（3）

緩沖液（buffer）10X第43頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第44頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.5在實驗室條件下進行限制性酶切設計一個最普通的酶切體系總體系20ul10×bufferH2ul切割的DNA分子16ul限制性內(nèi)切酶BglII

(4u/ul)0.5ulH2O其余用H2O補齊體系37℃2小時第45頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.5在實驗室條件下進行限制性酶切影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：酶活定義：指在最適反應條件下（因酶而異，包括最適反應溫度，最適緩沖條件），經(jīng)過1小時反應將1ugDNA完全分解所需要的酶量，稱為酶活單位；影響酶活的因素：DNA的純度：限制性內(nèi)切酶消化DNA底物的反應效率，很大程度上取決于所使用DNA本身的純度，而DNA制劑中的某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA以及SDS等都可以抑制酶的活性。如果DNA純度不夠，可以采用擴大反應體系來稀釋雜質(zhì)含量；酶切消化的反應溫度：大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的標準反應溫度是37℃，也存在許多例外條件，如BamHI30℃,AccIII60℃，TaqI65℃;在實際試驗中,甲基化和星號活性是很少的.大多數(shù)切不開都與自己的體系或者DNA質(zhì)量有關(guān).第46頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6對限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進行分析標準電泳不能區(qū)分大小凝膠電泳可區(qū)分大小第47頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6對限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進行分析表3-1瓊脂糖凝膠濃度與分辨DNA大小范圍的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度/（%） 可分辨的線性DNA大小范圍/（kb）0.3 60~50.6 20~10.7 10~0.80.9 7~0.51.2 6~0.41.5 4~0.22.0 3~0.1更小的DNA片段區(qū)分可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，40%聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分1-300bp的片段實驗室通常操作的DNA片段在0.5-10kb左右，所以一般使用0.8-1%的瓊脂糖凝膠基因組則一般使用0.5-0.7的的瓊脂糖凝膠第48頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6對限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進行分析上樣緩沖液：

6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。（40%蔗糖）第49頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6對限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進行分析第50頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6對限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進行分析凝膠中DNA分子的可視化EB在紫外照射下能把DNA分子顯示出來Gelred，SYBRGreen，Goldview等放射自顯影（檢測極微量的DNA）第51頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.7DNA分子大小的估計第52頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.8通過作圖標出一個DNA分子上的限制性酶切位點第53頁/共66頁4.2切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.8通過作圖標出一個DNA分子上的限制性酶切位點第54頁/共66頁4.3連接-將DNA連接在一起第55頁/共66頁4.3連接-將DNA連接在一起4.3.1DNA連接酶的作用模式第56頁/共66頁5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

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AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第57頁/共66頁4.3連接-將DNA連接在一起