基因表達調(diào)控-1

基因表達調(diào)控-1第1頁/共38頁基因表達的調(diào)節(jié)在多個水平上進行

轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控:組蛋白修飾等

轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控:

轉(zhuǎn)錄酶、啟動子、順式元件、反式因子轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控：

mRNA剪接

mRNA編輯

mRNA穩(wěn)定翻譯水平的調(diào)控：蛋白質(zhì)合成速度的控制翻譯后水平的調(diào)控蛋白質(zhì)修飾蛋白質(zhì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的靶向運輸?shù)?頁/共38頁基因表達的誘導(dǎo)和阻遏

誘導(dǎo)表達（inducedexpression）：在特定環(huán)境信號刺激下，使基因開放或表達增強的調(diào)節(jié)方式阻遏表達（repressedexpression）：在特定環(huán)境信號刺激下，使基因關(guān)閉或表達下降的調(diào)節(jié)方式

順式作用和反式作用

順式作用元件：在基因旁側(cè)序列中或基因內(nèi)部，可影響基因表達的特定DNA序列，包括啟動子、增強子、沉默子，絕緣子等；與順式元件相關(guān)的基因表達調(diào)節(jié)稱作順式作用；反式作用因子：可直接和間接與順式作用元件結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。與反式調(diào)節(jié)因子相關(guān)的基因表達調(diào)節(jié)稱作反式作用。第3頁/共38頁轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

㈠順式作用元件：包括啟動子（promoter）、增強子（enhancer）和沉默子（silencer），絕緣子（insulator）等。

1．啟動子：轉(zhuǎn)錄起始位點前，RNA聚合酶結(jié)合處，含有多個調(diào)控元件

包括至少一個轉(zhuǎn)錄起始位點以及一個以上的功能元件

Initiator(Inr):位于轉(zhuǎn)錄起始位點處，保守序列為YYCAYYYYY

TATAbox：位于-25至-35的區(qū)域，保守序列為TATAAAATFIID結(jié)合位點

CAATbox：位于-70至-80的區(qū)域，保守序列為CCAAT序列

NF1結(jié)合位點

GCbox:位于-80至-110的區(qū)域，保守序列為GCCACACCC或GGGCGGGSP1結(jié)合位點

混合堿基代碼：Y=C/T;R=A/G;M=A/C;W=A/T;K=G/T;S=G/C第4頁/共38頁真核細胞含有三種不同的RNApolymerase，分別用于不同基因的轉(zhuǎn)錄：·RNApolymeraseI：轉(zhuǎn)錄rRNA·RNApolymeraseII：轉(zhuǎn)錄mRNA·RNApolymeraseIII：轉(zhuǎn)錄tRNA和其它小RNAs.每種RNAPolymerase結(jié)合的啟動子性質(zhì)有所不同。第5頁/共38頁

啟動子模式圖第6頁/共38頁

TATA-less啟動子不含TATABox的啟動子稱TATA-less啟動子（占50%）

TATA-less啟動子通常在轉(zhuǎn)錄起始位點的下游含一個下游啟動子元件R-G-W-C-G-T-G(downstreampromoterelement，DPE)，位于+30處.

核心啟動子要么由TATAbox+InR要么由InR+DPE構(gòu)成.第7頁/共38頁2．增強子

增強子是遠離轉(zhuǎn)錄起始位點（1-30kb）、通過啟動子來增強基因表達的調(diào)控元件增強子有以下特點：

①可提高同一DNA鏈上靶基因的轉(zhuǎn)錄效率；②對細胞和組織有很強的特異性。但對所作用的基因無專一性，提示增強子的作用需要組織專一性的轉(zhuǎn)錄因子；③增強子的效應(yīng)與其位置和方向無關(guān)。增強子可在基因的

5′上游，基因內(nèi)或3′下游序列中；第8頁/共38頁3.絕緣子能阻止附近的調(diào)控元件對基因轉(zhuǎn)錄的活化或抑制。絕緣子發(fā)揮作用的模式圖第9頁/共38頁4．沉默子（silencer）

在DNA中，有些調(diào)控序列對轉(zhuǎn)錄有抑制作用，當(dāng)這些位點被阻遏物占據(jù)，可使其附近的啟動子失活，基因便不能表達，這種調(diào)控序列就稱為沉默子。

㈡反式作用因子

又稱轉(zhuǎn)錄因子，能直接或間接地識別或結(jié)合在各順式作用元件8-12bp核心序列上，參與調(diào)控靶基因表達效率的蛋白質(zhì)。

按其功能特性將轉(zhuǎn)錄因子分為三類：

1．基本轉(zhuǎn)錄因子：與RNAPolymerase一道組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物

2．轉(zhuǎn)錄激活/抑制因子：直接與DNA元件結(jié)合并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用

3．輔助調(diào)節(jié)因子：不直接與DNA元件結(jié)合，但通過蛋白-蛋白相互作用，在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與轉(zhuǎn)錄激活/抑制因子間搭建聯(lián)系的橋梁。-第10頁/共38頁轉(zhuǎn)錄因子至少包括兩個不同的功能結(jié)構(gòu)域：

DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

⑴DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要包括以下幾種類型

①螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋（helix-turn-helix，H-T-H）：蛋白質(zhì)分子中的兩個α螺旋通過一段短肽形成的“轉(zhuǎn)折”連接。

第11頁/共38頁②鋅指（zincfinger）結(jié)構(gòu)：由氨基端的2個反向平行的β-折疊和羧基端1個α-螺旋組成。在鋅指結(jié)構(gòu)的N-端有兩個相近的半胱氨酸，在C-端有一對相鄰的組氨酸，它們在空間上形成一個能容納Zn2+的洞穴，而且洞穴內(nèi)的Zn2+能與這4個氨基酸殘基配位連接而形成手指樣的形狀。

第12頁/共38頁③亮氨酸拉鏈（leucinezipper，ZIP）

每個單體構(gòu)成半個拉鏈，它具有形成α-螺旋的特點，其中每隔6個氨基酸就有1個亮氨酸或疏水氨基酸，導(dǎo)致第7個亮氨酸或疏水氨基酸殘基都在α-螺旋的同一側(cè)出現(xiàn)，它是部分轉(zhuǎn)錄因子二聚體生成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。第13頁/共38頁第14頁/共38頁④堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix，bHLH）結(jié)構(gòu)

bH-L-H結(jié)構(gòu)由兩個雙性的α-螺旋和夾在其中的由氨基酸殘基組成的環(huán)形成，靠近第一個α-螺旋的氨基端有一個堿性區(qū)，可與DNA的大溝結(jié)合。

第15頁/共38頁⑵轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域：以下的結(jié)構(gòu)為不同的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域

①帶負電荷的α-螺旋結(jié)構(gòu)域

②富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域

③富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域

④不規(guī)則的含有雙性α-螺旋和酸性氨基酸的結(jié)構(gòu)域第16頁/共38頁轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

第17頁/共38頁

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的生成RNApolymerase：

所有真核RNApolymerases含有約10多個亞單位，分子量>500kD.第18頁/共38頁TFIID：與TATABox結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，亞單位含：

TBP(TATAbindingprotein);TAFs（與TBP結(jié)合的因子）.

TFIID中所含的TAF種類和數(shù)量可有不同，含不同TAF的TFIID識別不同的基因啟動子。

TAFII230是TBP與TATA結(jié)合的抑制性亞單位。第19頁/共38頁TFIIA：釋放TAFII230，增加TBP的TATA結(jié)合能力；TFIIB：結(jié)合在TATABox的下游區(qū)域，協(xié)助RNAPolII定位；TFIIF：含兩個亞基，大亞基為解螺旋酶，小亞基參與RNAPolII定位；TFIIE:DNA解鏈，促RNAPolII移動；TFIIH：解旋酶、ATPase、Kinase，促RNAPolII

脫離啟動子，進入RNA合成的延伸過程TFIIJ：協(xié)助TFIIH工作。第20頁/共38頁

轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控

未被剪接的RNA初始轉(zhuǎn)錄物，因長度很不均一，因此被稱為異質(zhì)性核內(nèi)RNA（heterogeneousnuclearRNA）

㈠初級轉(zhuǎn)錄本的加工

1．初級轉(zhuǎn)錄本的剪接、

5′加帽、3′加尾2．RNA的編輯（RNAediting）

RNA編輯是RNA分子的一種修飾現(xiàn)象，DNA在轉(zhuǎn)錄成hnRNA后，因插入、刪除或堿基替換而改變了DNA模板原來的遺傳信息第21頁/共38頁mRNA的編輯(mRNAediting)人類apoB基因

mRNA（14500個核苷酸）肝臟apoB100（分子量為500000）腸道細胞apoB48（分子量為240000）mRNA編輯

C2153-U2153

CAA-UAA第22頁/共38頁

研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方法ReportergeneassayEMSA(Electrophoreticmobilityshiftassay)Foot-pringtingMethylationassayTet/offandTet/onassayNorthernBlottingChIPSAGEWesternblottingassayPCRassay第23頁/共38頁

ReporterGeneAssayTechnique

Forpromoter,enhancer,silencerandtranscriptoractivity第24頁/共38頁

Reportergenesusedinreportergeneassay:1)Luciferase,Luc

ATP+luciferin+O2AMP+oxyluciferin+PPi+light

第25頁/共38頁2)b-galactosidase,b-GalX-gal5-bromo-4-chloro-indigo第26頁/共38頁3)Chloramphenicolacetyltransferase,CATChloramphenicol+C14-acetyl-CoAC14-acetyl-Chloramphenicol+CoA第27頁/共38頁4)Greenfluorescentprotein,GFP

FrombioluminescentjellyfishAequoreavictoriaDiscoveredbyShivomuraat1962

238Aa,11b-sheets,Ser-65/Tyr-66/Gly-67第28頁/共38頁用于報告基因分析的質(zhì)粒載體第29頁/共38頁第30頁/共38頁Howtousereporterassayinyourexperiments:1.todeterminetranscriptionalactivityofpromoter2.toidentifypromoterandcis-elements3.toasaayinterractionbetweencis-elementandtrans-factor4.tostudyenhancerandsilencer5.tostudyeffectsofenvironmenta