基因診斷肝炎

基因診斷肝炎第1頁/共22頁乙型肝炎

病例顏先生，男，47歲，在一家大公司任公關(guān)部經(jīng)理。近兩個(gè)月感覺乏力、納差，每次應(yīng)酬都不勝酒力。20天前皮膚及鞏膜開始發(fā)黃。到醫(yī)院檢查肝功能顯示谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶增高，總膽紅素、間接膽紅素增高，乙肝表面抗原陽性。診斷為乙型肝炎公司同事知道顏先生患乙肝后，都對其敬而遠(yuǎn)之，午餐時(shí)顏先生總是形單影只，獨(dú)自悶頭吃飯，與以往呼朋喚友的情形反差甚大。第2頁/共22頁常規(guī)檢查基因診斷優(yōu)勢乙肝病毒基因組結(jié)構(gòu)基因診斷技術(shù)

基本技術(shù)重點(diǎn)技術(shù)乙型肝炎

基因診斷第3頁/共22頁

乙型肝炎

常規(guī)檢查乙肝（乙型病毒性肝炎）五項(xiàng)檢查乙肝（乙型病毒性肝炎）病毒DNA檢測肝功能檢查B超甲胎蛋白(AFP)第4頁/共22頁乙型肝炎基因診斷優(yōu)勢目前研究發(fā)現(xiàn)，許多表面抗原陰性的異型乙肝并不少見，不少乙肝患者雖然只表現(xiàn)為抗體（如核心抗體，e抗體等）為陽性，但是肝功能反復(fù)異常，進(jìn)一步檢查乙肝病毒DNA往往為陽性，這些人也是乙肝現(xiàn)癥感染者。基因診斷是通過較為先進(jìn)的檢測技術(shù)（例如聚合酶鏈反應(yīng)）檢測出體內(nèi)極其微量的乙肝病毒DNA基因，是一種新的檢驗(yàn)方法。乙肝病毒DNA是乙肝病毒復(fù)制的發(fā)動機(jī)。第5頁/共22頁乙型肝炎基因組結(jié)構(gòu)雙鏈缺口環(huán)型DNA，約3.2kb，分為正、負(fù)鏈。負(fù)鏈為長鏈，長度固定；正鏈為短鏈，長度可變。在粘性末端各有11bp組成的直接重復(fù)（DR）序列，分為DR1和DR2區(qū)。乙肝病毒基因組DNA有四個(gè)開放讀碼框架（ORFs），分別為S、C、P和X區(qū)，其中P區(qū)分別與S、C和X區(qū)相互重疊。第6頁/共22頁乙型肝炎

基本技術(shù)斑點(diǎn)雜交原位雜交DNA印跡和RNA印跡雜交技術(shù)核酸電泳聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基因芯片核酸雜交第7頁/共22頁乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反向斑點(diǎn)雜交生物芯片技術(shù)第8頁/共22頁海量PPT模板免費(fèi)下載乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之一PCR擴(kuò)增HBV基因特征序列

檢測乙肝病毒DNAPCR擴(kuò)增HBV基因特征序列

檢測乙肝病毒DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）作為一種簡便高效的基因擴(kuò)增技術(shù)，具有極高的檢測靈敏度和特異性，通過擴(kuò)增并檢測HBVDNA保守區(qū)的一段特殊序列而達(dá)到對乙肝病毒的檢測目的。相對于常規(guī)的PCR檢測方法，熒光定量PCR克服了假陽性缺點(diǎn)，能對HBV-DNA實(shí)時(shí)定量測定。第9頁/共22頁P(yáng)CR檢測中的要點(diǎn)

引物是決定PCR產(chǎn)物是否特異，反應(yīng)能否成功進(jìn)行的關(guān)鍵。設(shè)計(jì)引物有如下原則乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之一第10頁/共22頁MD24,MD26的介紹：以上引物為X基因中最保守的序列，該引物分別位于乙肝病毒基因組的1400~1423和1627~1610位，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為227bp乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之一第11頁/共22頁熒光定量PCR原理示意圖乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之一第12頁/共22頁反向斑點(diǎn)雜交（RDB）法乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之二反向斑點(diǎn)雜交（RDB）具有快速、簡便、高敏感性、特意性強(qiáng)的特點(diǎn)，尤其是基因分型、基因突變檢測，病原體的檢測等方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢。本次實(shí)驗(yàn)的基本原理是通過PCR擴(kuò)增將DIG-11-dUTP摻入目的產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物變性后與固定在膜上的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，然后通過酶免疫顯色法獲取結(jié)果。第13頁/共22頁乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之二RDB檢測乙型肝炎病毒(HBV)基本核心啟動子區(qū)A1762T/G1764A突變A1762T/G1764A是位于X基因上的位點(diǎn)突變，核苷酸1762位上的腺嘌呤轉(zhuǎn)換成了胸腺嘧啶，A-T突變；1764位上的鳥嘌呤轉(zhuǎn)換成了腺嘌呤，G-A突變。實(shí)驗(yàn)步驟：1、確定檢測對象5例A1762/G1764病毒株血清2例T1762/G1764病毒株血清5例A1762/A1764病毒株血清4例T1762/A1764病毒株血清第14頁/共22頁2、引物、探針設(shè)計(jì)與合成3、檢測陣列制備，手工點(diǎn)樣探針點(diǎn)樣區(qū)域第15頁/共22頁4、PCR擴(kuò)增5、雜交、洗膜和顯色結(jié)果：第16頁/共22頁生物芯片根據(jù)檢測對象分為：基因芯片和蛋白質(zhì)芯片優(yōu)點(diǎn)：縮短肝炎病毒感染窗口期，減少漏檢和誤檢。耗血量少，多指標(biāo)檢測更簡便更高效。生物芯片技術(shù)采用最先進(jìn)的技術(shù)，準(zhǔn)確性好。

生物芯片技術(shù)乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之三第17頁/共22頁大量特定的核酸片段或蛋白質(zhì)有序固定在載體上

與待檢核酸或蛋白質(zhì)分子進(jìn)行反應(yīng)檢測光信號的強(qiáng)弱并判斷樣本中的靶分子數(shù)量

乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之三生物芯片技術(shù)第18頁/共22頁乙型肝炎

重點(diǎn)技術(shù)之三基因芯