基因文庫(kù)的建立

基因文庫(kù)的建立第1頁(yè)/共38頁(yè)基因文庫(kù)(genelibrary)基因組文庫(kù)(genomiclibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)

第2頁(yè)/共38頁(yè)第一節(jié)基因組文庫(kù)的構(gòu)建

第3頁(yè)/共38頁(yè)定義：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。一.基因組文庫(kù)的規(guī)模

N—基因組文庫(kù)克隆總數(shù)P—所需機(jī)率

N=f—插入片段與基因組DNA長(zhǎng)度之比

二．建立基因組文庫(kù)的一般程序

1．載體DNA片段的制備

DNA分離純化限制酶切脫磷酸化反應(yīng)

2．供體DNA片段的制備總DNA分離純化機(jī)械剪切法分離特定大小DNA片段酶法部分酶切分離特定大小DNA片段完全酶切

ln（1-P）ln（1-f）第4頁(yè)/共38頁(yè)

3.供體與載體DNA連接

要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總DNA濃度和兩種DNA分子的克分子比率。

4.重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增

利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被擴(kuò)增（重組子比率可能發(fā)生變化）

5.基因組文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)

1）文庫(kù)規(guī)模----隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)粒DNA，電泳測(cè)定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計(jì)算文庫(kù)大小。

2）重組頻率----頻率越高，質(zhì)量越高，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。第5頁(yè)/共38頁(yè)

三.

利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)該法簡(jiǎn)單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。第6頁(yè)/共38頁(yè)四.

利用λ載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

1.載體DNA片段的制備方法:

左右臂DNA片段的獲得

2.供體DNA片段的制備:限制酶部分酶切，機(jī)械剪切法

3.重組DNA分子的形成：

控制克分子比率，使其形成串狀DNA分子

4.重組DNA分子的包裝

1）λDNA的包裝物的制備

使用的大腸桿菌菌株：

E.coliBHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包裝蛋白

E.coliBHB2690(N205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-頭部蛋白第7頁(yè)/共38頁(yè)第8頁(yè)/共38頁(yè)

i.

兩菌株分別培養(yǎng)，分別收集和制備，包裝前混合----本底低（對(duì)λDNA分子大小有嚴(yán)格限制），高效。

ii.

兩菌株分別培養(yǎng)，混合收集和制備----操作簡(jiǎn)單，本底高，可包裝不同大小的λDNA分子。

2）重組λDNA分子的包裝過(guò)程包裝制備物（-70℃）于冰上緩慢融化加入重組λDNA分子邊融化邊混合邊包裝離心除去細(xì)胞碎片λ顆粒于-70℃保存待用5.基因組文庫(kù)的擴(kuò)增

包裝的λ顆粒感染E.coli

培養(yǎng)分離λ顆粒-70℃保存第9頁(yè)/共38頁(yè)五.

利用COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

構(gòu)建過(guò)程與λ載體構(gòu)建過(guò)程相似:兩臂DNA片段的制備，供體DNA片段的制備，兩DNA的連接和重組DAN分子的包裝。單COS質(zhì)粒載體和雙COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)。

為提高文庫(kù)質(zhì)量，可采取以下措施：

1.

雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避免其自身形成串狀體

2.供體DNA脫磷酸化以避免供體DNA間的連接導(dǎo)致重排

3.載體和供體DNA末端修飾以避免上述兩種情形發(fā)生載體DNAXhoIorSalI酶切補(bǔ)CT連接重組DNA供體DNASau3AI部分酶切補(bǔ)AG

4.采用文庫(kù)快速構(gòu)建法以避免擴(kuò)增文庫(kù)時(shí)DNA丟失第10頁(yè)/共38頁(yè)利用單COS質(zhì)粒載體文庫(kù)第11頁(yè)/共38頁(yè)利用雙COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

第12頁(yè)/共38頁(yè)

六.利用P1載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

構(gòu)建過(guò)程也與λ載體構(gòu)建過(guò)程十分相似:1.兩臂DNA片段的制備:pAD10sacBBamHI/ScaI2.

供體DNA片段的制備:部分酶切蔗糖梯度離心3.

兩DNA的連接和重組DAN分子的包裝

1)

包裝物制備用菌株:E.coliNS3208[=MC1061,supo

recD1014hsdR-

hsdM+

mcrA-

mcrB-(P1r-m-cm-2c1.100am10.1)]:制備pacaseE.coliNS3210[=MC1061,supo

recD1014hsdR-

hsdM+

mcrA-

mcrB-(P1r-m-cmc1.100am131)]:制備頭部蛋白

2)重組DNA分子的包裝與感染與λ重組子包裝相似,然后感染E.coliNS3529=E.coliK12recAmcrAΔ(hsdRhsdMmcrBmcrCmrr)(λimm434nin5X1-cre)(λimmλLP1),每微克DNA可在Kanr平板上4X105-2X106Kanr。第13頁(yè)/共38頁(yè)利用P1載體構(gòu)建基因組文庫(kù)第14頁(yè)/共38頁(yè)七.利用YAC載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

1.兩臂DNA片段的制備:

pYAC4BamHI/EcoRI脫磷酸化

2.供體DNA片段的制備:

瓊脂糖凝膠-DNA樣品的制備EcoRI部分酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳片段回收和純化

3.DNA的連接

4.重組DAN分子的轉(zhuǎn)化:

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

5.轉(zhuǎn)化子的保存:

單菌落保存于96孔平板中第15頁(yè)/共38頁(yè)酵母人工染色體構(gòu)建第16頁(yè)/共38頁(yè)第二節(jié)cDNA文庫(kù)的建立第17頁(yè)/共38頁(yè)定義：從一定生長(zhǎng)階段或條件的某種細(xì)胞分離到的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再重組和增殖所產(chǎn)生的無(wú)性繁殖系的總和。一．cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)

1.基因特異性常來(lái)自結(jié)構(gòu)基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表那些正在表達(dá)的基因的遺傳信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA

2.器官特異性不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫(kù)也就不同第18頁(yè)/共38頁(yè)4.不均勻性

在同一個(gè)cDNA文庫(kù)中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的。這與基因組文庫(kù)中的單拷貝基因均具有相同的克隆數(shù)相較，這是兩種文庫(kù)的另一差別。

5.各cDNA均可獲得表達(dá)（一般選用的載體都是表達(dá)型的）3.代謝或發(fā)育特異性處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)亦不相同

第19頁(yè)/共38頁(yè)二.cDNA文庫(kù)的規(guī)模N=f為某一特定cDNA（mRNA）的分子數(shù)目與全部cDNA

（mRNA）分子數(shù)目之比三.建立cDNA文庫(kù)的一般程序

1.載體DNA片段的制備

2.多聚（A）RNA的分離與純化

3.雙鏈cDNA的合成

1）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法

2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子ln(1―p)ln(1―f)第20頁(yè)/共38頁(yè)

2）同聚物加尾：可大大減少載體DNA自身連接

3）cDNA的定向插入5.重組cDNA分子的轉(zhuǎn)移和文庫(kù)的建立選用載體為質(zhì)粒，可直接轉(zhuǎn)化E.coli；若為λ載體，則需進(jìn)行體外包裝、感染等。4.ds-cDNA與載體DNA相連

1）人工接頭：要求具平端ds-cDNA，酶切時(shí)可能導(dǎo)致某些cDNA鏈斷裂第21頁(yè)/共38頁(yè)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

第22頁(yè)/共38頁(yè)cDNA的定向插入

第23頁(yè)/共38頁(yè)四.

建立cDNA文庫(kù)的特殊方法

1.Okayama–Berg法

1）T引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第一條cDNA鏈

2）G引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第二條cDNA鏈

3）第一條cDNA鏈合成：T引物與mRNA退火反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

4）第二條cDNA鏈的合成：

a.

第一條cDNA鏈3’-末端加尾（dCTP）

b.

限制酶切除去載體上所加的多聚C尾巴

c.與G引物退火

d.

除去RNAe.

合成第二條cDNA鏈

5）cDNA文庫(kù)的形成—轉(zhuǎn)化該法的優(yōu)點(diǎn)：獲全長(zhǎng)cDNA，并使cDNA表達(dá)的可能性提高一倍，因?yàn)閏DNA插入方向與載體上啟動(dòng)子方向一致。第24頁(yè)/共38頁(yè)

Okayama-BergcDNA文庫(kù)構(gòu)建第25頁(yè)/共38頁(yè)2.Okayama–Berg改進(jìn)法該法集中了常規(guī)方法和Okayama–Berg法的優(yōu)點(diǎn)，第一條cDNA鏈合成用常規(guī)法，但在3’-端加尾后，其余步驟與Okayama–Berg法相同第26頁(yè)/共38頁(yè)3.SMART(SwitchMechanismAtthe5’endofRNATemplates)方法

1)當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶合成到mRNA模板5’端后，它會(huì)在第一鏈的3’端加上幾個(gè)C；

2)合成的寡核苷酸G與C配對(duì)；

3）反轉(zhuǎn)錄酶以新合成的cDNA為模板，繼續(xù)合成第二條cDNA鏈；

4）LDPCR—LongDistancePCR第27頁(yè)/共38頁(yè)第28頁(yè)/共38頁(yè)第29頁(yè)/共38頁(yè)4．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR法）

1)引物的合成：

T引物—5’-端富含GC，可提高退火溫度，避免非特異性變性發(fā)生，因?yàn)?’-端含低聚dTG引物—5’-端富含AT，便于與載體相連，3’-端含低聚dG

2)cDNA的PCR擴(kuò)增：

采用TaqDNA聚合酶，方法是：變性與引物復(fù)性鏈延伸下一個(gè)循環(huán)

3)cDNA連接方式：用匹配接頭第30頁(yè)/共38頁(yè)P(yáng)CR法構(gòu)建cDNA文庫(kù)第31頁(yè)/共38頁(yè)

3.供體與載體DNA連接

要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總DNA濃度和兩種DNA分子的克分子比率。

4.重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增

利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被