實驗2重組質粒的提取及鑒定2012邵

1實驗二 重組DNA的提取及酶切鑒定復旦大學上海醫(yī)學院醫(yī)學實驗教學中心邵紅霞;.cn2一、實驗目的掌握以下方法和技術：1.質粒DNA的小量快速制備2.質粒DNA的限制性內切酶酶切3.DNA的瓊脂糖凝膠電泳3二、實驗原理

分離質粒DNA有三個步驟：1.培養(yǎng)細菌使質粒擴增2.收集和裂解細菌（本實驗：SDS裂解）

3.分離和純化質粒DNA（本實驗：堿變性法）1.質粒DNA的小量快速制備4堿變性法抽提質粒DNASolutionIIpH12.6SolutionIIIpH4.8離心后去向染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋解開不能復性沉淀中質粒DNA氫鍵部分斷裂，cccDNA互補鏈不完全分離復性上清中52.質粒DNA的限制性內切酶酶切

EcoRI+ClaI雙酶切（酶切完全時）

瓊脂糖凝膠電泳凝膠中2條區(qū)帶

4.3kbpBR322質粒載體片段

1.4kbc-myc目的基因片段1.4kbEcoRIClaI4.3kbc-myc-pBR3225.7kb6 瓊脂糖——海藻中提取的線狀高聚物 加熱融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝膠3.瓊脂糖凝膠電泳78DNA在凝膠中的遷移率的影響因素DNA分子的大小瓊脂糖的濃度

DNA的構象

所加電壓嵌入染料的存在電泳緩沖液的組成及其離子強度910不同含量標準的瓊脂糖凝膠的分離范圍瓊脂糖凝膠濃度線狀DNA分子分離范圍（%，m/V）（kb）0.35~600.51~300.61~200.70.8~121.00.5~101.20.4~61.50.2~42.00.1~311

質粒DNA的3種構象瓊脂糖凝膠電泳凝膠中1、2、3條帶都有可能共價閉合環(huán)形DNA開環(huán)DNA線性DNA12DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液13 1%瓊脂糖凝膠電泳中： 溴酚藍遷移速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同； 二甲苯氰FF約與長4000bp的DNA相同增加樣品密度，以確保DNA均勻進入樣品孔里使樣品呈現顏色在電場中可預知速率（向陽極涌動的染料）14三、實驗器材與試劑（詳見實驗講義）15四、實驗步驟

（詳見實驗講義）1.質粒DNA的小量快速制備（AXYGENAxyPrep質粒DNA小量制備試劑盒）注意事項：1.首次使用前，將RNaseA全部加入BufferS1中，4℃貯存2.首次使用前，BufferW2concentrate中加入指定體積的無水乙醇3.使用前檢查BufferS2是否出現沉淀，若有應在37℃加熱溶解并冷卻至室溫使用4.自行準備無核酸和核酸酶污染的tip頭和離心管5.BufferS2使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率16用加樣槍將細菌培養(yǎng)物加入1.5ml離心管，12000rpm，1min加250μlBufferS1，吹打混勻（也可Vortex）以充分懸浮細菌加250μlBufferS2，上下顛倒，溫和混勻4~6次使菌體裂解加350μlBufferS3，上下顛倒，溫和混勻6~8次，12000g離心10min吸取上清至已置于2ml離心管的制備管中，12000g離心1min，棄濾液同上，在制備管中加500μlBufferW1，12000g離心1min，棄濾液在制備管中加700μlBufferW2，12000g離心1min，棄濾液，重復以BufferW2洗滌（離心）一次，再空離心1次將制備管移入新的1.5ml離心管，在膜中央加60μlEluent或去離子水，室溫靜置1min，12000g離心1min，即為質粒DNA。避免劇烈搖晃，此步驟不宜超過5min避免劇烈搖晃重復2次Eluent液65度溫育可提高洗脫效率請保持同步！離心機配平172.質粒DNA的限制性內切酶的雙酶切Buffer42μlEcoRⅠ(16U/μl)1μlClaⅠ(10U/μl)1μlddH2O6μl質粒DNA10μl20μl混勻后短暫離心，37℃水浴1小時注意：加樣順序保證每樣試劑加入反應體系乙?；疊SA可不加加樣完成后需混勻，短暫離心反應結束后需短暫離心后加凝膠加樣緩沖液及時將酶放回-20℃冰箱以保證酶的活力18準備好制膠器，插好梳子并保證梳子距底部0.5mm-1.2mm灌膠（事先加EB,帶手套，并及時更換手套）注意趕氣泡待凝準備好凝膠，加熱熔解19注意事項：標液面高度以觀察水分是否蒸發(fā)過多，若溶解后水分蒸發(fā)過多，補水2.三角燒瓶上覆打過洞的保鮮膜（防水蒸發(fā)）防爆沸和燙傷（帶手套）待冷卻至55℃左右加3μlEBr后立即灌膠（戴手套）稱量agarose加入TAE60ml，勿晃微波爐溶膠注意先做好制膠準備！20在電泳槽內加電泳緩沖液將制好的凝膠連同內架放入電泳槽內，保證液面高于凝膠面（在液體中拔去梳子）加入6×凝膠加樣緩沖液和DNA（1:5比例混合）依次加樣，并加好Marker連通電源，80V電泳至溴酚藍帶達到凝膠的1/2處結果觀察和記錄DNA從陰極向陽極遷移EBr從陽極向陰極遷移（加樣后不能移動電泳槽?。?1凝膠成像及分析系統(tǒng)223.DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳制膠：1%agarose（含2μlEB)，防過熱暴沸上樣準備（1份凝膠加樣緩沖液加5份DNA）上樣和電泳:每組上樣2個（未酶解質粒和雙酶切產物）未酶解質粒10μl+2μl凝膠加樣緩沖液雙酶切產物20μl+4μl凝膠加樣緩沖液Marker5μl,放中間，2組1塊膠

各組先做好準備，兩組統(tǒng)一集中上樣后電泳

電泳槽和電泳儀不可移動2312M34

M:λDNA/HindIIIMarkers2,3c-myc-pBR322重組質粒經ClaI/EcoRI雙酶切1,4c-myc-pBR322重組質粒（其中1應該加含RNase的ddH2O，卻加成了普通的ddH2O）4.3kb1.4kb231309