食物中毒采樣與檢驗(yàn)13407(00001)課件

細(xì)菌性食物中毒樣品的

采集及實(shí)驗(yàn)室檢測程序北京市疾病預(yù)防控制中心2013年4月

食物中毒樣品種類和采集方法采樣注意事項實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測程序食源性疾病WHO：由于食物中含有致病因子引起的以急性病理過程為主要臨床特征的感染性或中毒性疾病美國CDC：由于食用了受污染的食品或飲料而引起的疾病包括常見的食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲病及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)所引起的疾病。食源性疾患的發(fā)病率居各類疾病總發(fā)病率的前列，是當(dāng)前世界上最突出的衛(wèi)生問題。

細(xì)菌性食源性疾病細(xì)菌性食源性疾?。菏沁M(jìn)食被細(xì)菌或細(xì)菌毒素污染的食物而引起的感染性或中毒性疾病。細(xì)菌性腸道傳染?。ɑ魜y、痢疾、傷寒副傷寒、O157短期內(nèi)集中發(fā)病常被診斷為細(xì)菌性食物中毒散發(fā)或潛伏期較長病例常被診斷為胃腸炎或其他疾病食物中毒相關(guān)概念食物中毒：攝入了含有生物性、化學(xué)性有毒有害物質(zhì)的食品或者把有害物質(zhì)當(dāng)作食品攝入后出現(xiàn)的非傳染性(不屬于傳染病)的急性、亞急性疾病。食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)主要以流行病學(xué)調(diào)查資料及病人的潛伏期和中毒的特有表現(xiàn)為依據(jù)，實(shí)驗(yàn)室診斷是為了確定中毒的病因而進(jìn)行的食物中毒的致病因素2012年全國報告食物中毒917起

微生物引起的患者數(shù)最多，占總數(shù)的50%美國食源性疾病爆發(fā)細(xì)菌性的占總起數(shù)的75%，占病例數(shù)86%。我國細(xì)菌性食物中毒發(fā)生起數(shù)同樣常年居首位常見細(xì)菌性食物中毒沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉性大腸桿菌、副溶血性弧菌、其它致病性弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、出血性大腸桿菌O157、單增李斯特菌、耶爾森氏菌、空腸彎曲菌、變形桿菌、耶毒假單胞菌酵米面亞種、氣單胞菌、腸球菌等細(xì)菌性食物中毒的特點(diǎn)與飲食有密切關(guān)系，去除原因食品后，不再有新的患者。臨床癥狀以急性胃腸炎為主，基本相同。短時期內(nèi)多人發(fā)病，無人傳染人的現(xiàn)象。中毒發(fā)生與不同區(qū)域人群飲食習(xí)慣有密切關(guān)系。與季節(jié)相關(guān)。細(xì)菌繁殖條件及人體防御機(jī)能。發(fā)病率高，病死率較低、恢復(fù)快、多數(shù)預(yù)后良好

細(xì)菌性食源性疾病的流行病學(xué)傳染源：被病原菌感染的動物或人傳播途徑：通過進(jìn)食被細(xì)菌或其毒素污染的食物人群易感性：普遍，無病后免疫力，可重復(fù)感染流行特征：夏秋季高發(fā)；病例可散發(fā)或爆發(fā)流行；發(fā)病急，時間集中，潛伏期短；有共同進(jìn)餐史；癥狀輕重與進(jìn)食量有關(guān)。感染型活菌污染食品

|適宜條件食品中大量繁殖（菌量一般106）

|人攝入侵犯消化道粘膜

—消化道—體死亡放出內(nèi)毒素引起充血、水腫、滲出等炎癥作用于體溫調(diào)節(jié)中樞

發(fā)燒

消化道癥狀

細(xì)菌性食源性疾病的發(fā)病機(jī)制毒素型細(xì)菌污染食物在其中繁殖并產(chǎn)生大量毒素，人食入大量毒素的食物而造成的中毒。臨床癥狀與食入毒素量正相關(guān)起病急，不發(fā)熱，病程短，可引起敗血癥或嚴(yán)重毒血癥（葡萄球菌腸毒素、肉毒毒素）毒素型活菌污染食品

|適宜條件食品中大量繁殖產(chǎn)生外毒素（如腸毒素、神經(jīng)毒素等）|攝入含外毒素的食品而中毒|出現(xiàn)相應(yīng)外毒素的特殊臨床表現(xiàn)現(xiàn)場調(diào)查流程建立病例定義，制定采樣計劃（提出假設(shè)）驗(yàn)證假設(shè)可疑樣本采集和送檢實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采取控制措施調(diào)查結(jié)論和書面報告建立病例定義72h內(nèi)食用了共同餐次食品是否到醫(yī)院就診、是否服藥24h腹瀉3次以上癥狀體征明顯建立病例定義核實(shí)病例數(shù)確定事件的存在描述疾病的三間分布時間分布地區(qū)分布人群分布現(xiàn)場調(diào)查主要物品清單防護(hù)用品白色工作服或隔離衣、醫(yī)用手套、口罩等調(diào)查用表食物中毒個案調(diào)查表、衛(wèi)生監(jiān)督文書、采樣單等取證工具照相機(jī)、攝像機(jī)、錄音機(jī)其他相關(guān)專業(yè)參考資料食物中毒采樣目的

查明病因和來源確定檢驗(yàn)項目,驗(yàn)證假設(shè)為以后的分析結(jié)論提供證據(jù)食物中毒采樣意義

實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果是查明爆發(fā)原因的證據(jù)科學(xué)準(zhǔn)確合理地采集、運(yùn)送、保存標(biāo)本直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性食物中毒樣品種類剩余食品病人排泄物血液標(biāo)本尸體解剖標(biāo)本炊具類標(biāo)本現(xiàn)場環(huán)境標(biāo)本原料、半成品和成品從業(yè)人員標(biāo)本無菌操作采樣無菌操作：防止外界微生物的污染和病原菌擴(kuò)散所采用的操作技術(shù)食物中毒采樣目的是檢測標(biāo)本的實(shí)際污染狀況，故應(yīng)嚴(yán)格避免由于采樣對檢品造成的新的污染。要求采樣容器、用具、培養(yǎng)基需嚴(yán)格滅菌同時以無菌操作取樣。食物中毒采樣方法--生物標(biāo)本嘔吐物、洗胃液取新鮮即時的，避免混入其他雜質(zhì)和細(xì)菌，容器應(yīng)保證無菌糞便：黏液或膿血部分，液狀糞便采取絮狀物1-2mL,成型便取蠶豆大小糞塊（約5g）盛于滅菌容器，勿混入尿液或水。注意密封和標(biāo)簽肛拭子（直腸拭子法）：告知病人采樣目的使其配合

食物中毒采樣方法--生物標(biāo)本確定體位，詢問有無肛腸疾病，確定是否適合肛拭子采樣取出滅菌采便管觀察有無破損站在病人側(cè)位，矚病人深呼吸放松以采便管用生理鹽水浸濕后，插入肛門內(nèi)3—5cm,轉(zhuǎn)動360度后取出，插入運(yùn)送培養(yǎng)基。觀察病人情況有無出血等食物中毒采樣方法--生物標(biāo)本咽喉涂抹令患者仰頭張口、用壓舌板壓舌、將無菌棉拭子伸入口腔涂抹咽部數(shù)次，放入鹽水管血液：無菌穿刺取靜脈血2—3mL移入無菌試管中送檢。

生物標(biāo)本的采樣時機(jī)嘔吐物、洗胃液取新鮮即時的糞便（肛拭子）急性腹瀉期及藥前根據(jù)患者人數(shù)，決定采集數(shù)量咽喉涂抹：發(fā)病第一日，最遲不超過3日,最好在體溫38度以上時采集血液：無菌穿刺靜脈血。發(fā)病初期血液可做細(xì)菌培養(yǎng)。急性期（3天內(nèi)）和恢復(fù)期（2周左右）各采血一次，制備血清，有助于感染型食物中毒診斷。食物中毒采樣方法—工用具標(biāo)本鍋、盆、桶、刀、菜板滅菌棉拭子沾鹽水后反復(fù)涂擦，置于滅菌容器。棉拭子接觸手的部分及時用無菌鑷子折斷后置于鹽水管中。如菜板已洗過，可刮下表面木屑置于滅菌容器。抹布可剪下一塊置于滅菌容器。食堂環(huán)境涂抹：冰箱、水池等食物中毒采樣方法--從業(yè)人員對直接接觸食品的廚師和餐廳工作人員，可根據(jù)不同目的做帶菌檢查。采集手(皮膚)涂抹、肛拭子等樣本食物中毒采樣數(shù)量樣品名稱采樣數(shù)量固體食品200-500g(不同部位）液體及半流體食物200-500mL(充分?jǐn)嚢瑁﹪I吐物50—100g（每人）糞便5—10g（每人）容器洗滌水100—200mL（每件）血液5—10mL（每人）尸體標(biāo)本10—20g（每種臟器）標(biāo)本保存要求直腸拭子：48h內(nèi)檢測,保存于4℃;48h后檢測，保存于—70℃新鮮糞便：采集2h后冰箱保存腦脊液、尿液、唾液（24h內(nèi)處理）可室溫保存，長期保存條件4--8℃標(biāo)本保存要求分離病毒標(biāo)本：保溫容器（0--4℃）不可超過2天。無條件立即運(yùn)送和分離，需凍存。檢測抗體的血清：4℃可保存7—10天，最好不要冷凍，防止反復(fù)凍融使用冰袋保持樣品運(yùn)送溫度4—8℃保證-20℃條件應(yīng)使用2kg干冰病原微生物樣本的包裝WHO傳染性物質(zhì)和診斷性標(biāo)本的安全運(yùn)送指南確保人員安全和標(biāo)本完整使用三個包裝層對包裝物進(jìn)行三層包裝防漏、吸附材料標(biāo)簽標(biāo)識病原微生物樣本的運(yùn)送固定備有吸水材料、消毒劑、手套、口罩、密封防水廢棄物容器車載冷藏裝置、冰袋、冰壺等及時、專人、快速送檢采樣注意事項樣品應(yīng)做詳細(xì)記錄，體現(xiàn)樣本全部信息根據(jù)不同樣本性狀，檢驗(yàn)項目要求，合理保存和運(yùn)送樣品。一般要求4小時內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。夏秋季冷藏運(yùn)送。樣品采集時注意無菌操作，防止污染采樣量不受常規(guī)采樣數(shù)量限制。檢驗(yàn)?zāi)康拿鞔_重點(diǎn)突出食物中毒標(biāo)本的送檢與保存為避免樣本變質(zhì)和樣本中微生物增殖或死亡，送檢時間越快越好。運(yùn)送培養(yǎng)基中運(yùn)送并保持于合適溫度最好在采樣后4小時內(nèi)送檢，最好冷藏運(yùn)送。血液標(biāo)本低溫保存，不可冷凍包裝完整，密封良好，標(biāo)識清晰

采樣基本生物安全注意事項采樣前進(jìn)行手消毒或帶手套避免接觸不同患者時重復(fù)使用手套，防止交叉污染必要時穿防護(hù)服，采便時戴口罩廢棄物處理依生物安全相關(guān)規(guī)定執(zhí)行檢驗(yàn)項目選擇根據(jù)本起食物中毒臨床和流行病學(xué)資料分析初步推斷致病因素性質(zhì)和中毒原因（建立假設(shè)）確定檢驗(yàn)項目初步假設(shè)發(fā)病時間臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉人群分布“三間分布”趨勢病例之間有食物同源性，食用者發(fā)病、不吃者不發(fā)病，停止進(jìn)食發(fā)病即停止，為“劍鋒”初步判斷接報后通過初步分析和假設(shè)得出初步判斷是否是一個事件？什么性質(zhì)的事件？事件涉及范圍及嚴(yán)重性？事件的發(fā)展趨勢？爆發(fā)？流行？有無危重病人？需配合采取何措施？如何調(diào)動人力？準(zhǔn)備哪些個人防護(hù)、儀器設(shè)備？檢驗(yàn)項目選擇

假設(shè)的特征合理有現(xiàn)場調(diào)查事實(shí)支持能夠解釋大多數(shù)病例注意現(xiàn)場觀察，保持開放性思維，請教相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜夷壳笆澄镏卸静蓸拥钠顝V泛性采樣，缺乏針對性盲目性（采集現(xiàn)場所有樣本，做全項致病菌檢測）大海撈針采樣不全面，檢測項目為固定模式缺乏溝通，前后脫節(jié)致病物質(zhì)不明食物中毒食入可疑中毒食品引起的食物中毒由于取不到樣品或已經(jīng)無法查出致病物質(zhì)在學(xué)術(shù)上中毒物質(zhì)不明診斷依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料病人潛伏期和特有臨床表現(xiàn)致病物質(zhì)不明食物中毒報告遲赴現(xiàn)場遲、不能及時采樣不能采集到關(guān)鍵樣本或病人已用藥檢測項目針對性不強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室能力致病物質(zhì)不明食物中毒分離不到病原性微生物可能的原因有

L型細(xì)菌技術(shù)和設(shè)備的原因病原性微生物的數(shù)量很少，培養(yǎng)不出來細(xì)菌處于非可培養(yǎng)的狀態(tài)現(xiàn)有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)技術(shù)不適合這種微生物的生長新的病原微生物？細(xì)菌性食物中毒實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則盡快找到病原，快速準(zhǔn)確允許與傳統(tǒng)方法不一致實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室必須常規(guī)配備各類樣品的采集材料、常用的培養(yǎng)基、微量生化管或生化試劑條、常用的診斷血清，并保證在有效期內(nèi)對不常用的采樣材料，細(xì)菌鑒定所用的試劑、試紙條也應(yīng)適量儲備從事細(xì)菌性食物中毒檢驗(yàn)工作的檢驗(yàn)人員需經(jīng)過專業(yè)知識和專業(yè)技能的學(xué)習(xí)，并能勝任檢驗(yàn)工作的實(shí)際需要。

細(xì)菌性食物中毒實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測程序初步檢驗(yàn)直接涂片檢查（霍亂弧菌、彎曲菌）活菌數(shù)測定蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等分離培養(yǎng)初篩純培養(yǎng)全面鑒定細(xì)菌鑒定生化、血清、分子生物學(xué)抗體測定血清凝集效價毒素檢測免疫學(xué)、儀器法、PCR、動物實(shí)驗(yàn)細(xì)菌性食物中毒實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測程序應(yīng)用直接分離及增菌雙重培養(yǎng),直接分離可檢出樣品中的優(yōu)勢菌(包括一些條件致病菌)增菌可將樣品中污染的但與菌量較少的致病菌檢出對服藥患者肛拭樣品中被抗生素抑制的細(xì)菌達(dá)到復(fù)蘇和增加菌量的作用。檢樣處理生物樣本一般不需要預(yù)增菌但服用抗生素的檢樣需要預(yù)增菌，直接插入2mLTSB37℃4—6h按檢驗(yàn)方法要求接種相應(yīng)增菌液，再轉(zhuǎn)種相應(yīng)培養(yǎng)基初篩方法三糖鐵PCRVIDASBAX直接培養(yǎng)將處理后的檢樣直接接種于各種培養(yǎng)基上

⑴需氧培養(yǎng)

普通瓊脂平板蠟樣芽孢桿菌及其他未知菌血平板葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基大腸埃希氏菌、變形桿菌

麥康凱培養(yǎng)基大腸埃希氏菌、變形桿菌

HE、SS培養(yǎng)基沙門氏菌、志賀氏菌

TCBS培養(yǎng)基副溶血性弧菌⑵厭氧培養(yǎng)

葡萄糖血瓊脂平板產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌

CCDA空腸彎曲菌

增菌培養(yǎng)（與直接培養(yǎng)同時進(jìn)行）⑴需氧菌增菌培養(yǎng)基

7.5%NaCl肉湯金黃色葡萄球菌葡萄糖肉浸液肉湯溶血性鏈球菌

TTB、SC增菌液沙門氏菌志賀氏菌增菌液志賀氏菌3.5%NaClAPW副溶血性弧菌腸道菌增菌液EC病原性大腸埃希氏菌⑵厭氧菌增菌庖肉培養(yǎng)基產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌

血清學(xué)試驗(yàn)

將病人急性期和恢復(fù)期的血清與所分離的病原菌做試管凝集試驗(yàn)，如恢復(fù)期血清凝集效價較發(fā)病初期有4倍以上升高，則有診斷價值。毒素檢測及動物試驗(yàn)

依食物中毒種類而定，目的是確定分離菌株的致病力。動物實(shí)驗(yàn)在證實(shí)可疑食品（或分離菌株及其毒素）與該起食物中毒的關(guān)系時，是一個重要指標(biāo)，特別是對某些條件致病菌引發(fā)的食物中毒尤為重要。常用動物有大白鼠、小白鼠、家兔、貓、猴等。給毒途徑有經(jīng)口灌胃、腹腔注射或結(jié)腸袢試驗(yàn)。液體食品可直接灌胃或注射；固體食品需經(jīng)無菌水研磨浸出毒性物質(zhì)，離心后取上清液進(jìn)行試驗(yàn)。也可用分離菌株培養(yǎng)物或其濾液進(jìn)行試驗(yàn)。觀察時間一般3—6天。每次試驗(yàn)必須設(shè)對照組。動物實(shí)驗(yàn)毒力基因檢測金黃色葡萄球菌腸毒素——ELASAETEC侵襲毒素、ETEC腸毒素、副溶血性弧菌蠟樣芽孢桿菌腸毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌毒素——PCR

檢驗(yàn)結(jié)果判定原則以找到病原體或其毒力基因?yàn)樽罱K結(jié)論快速檢測結(jié)果僅供參考注意非病原檢樣與病原檢樣檢出病原菌的一致性判定原則

多數(shù)患者樣本中檢出的致病意義明確的細(xì)菌在其種類、生化、血清型、毒素型均一致時，可以報告非病原檢樣與病原檢樣檢出占有絕對優(yōu)勢的致病意義不甚明確的細(xì)菌（大腸桿菌、溶藻弧菌。。。）且細(xì)菌種類、生化血清型均一致，同時本次事件中非患者對照未檢出時，應(yīng)加做毒力、動物試驗(yàn)，陽性結(jié)果可以報告判定原則

樣本中檢出致瀉大腸桿菌、金葡時，一定要做腸毒素檢測為最終結(jié)論蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌必須計數(shù)105cfu/g以上食物中毒檢驗(yàn)重要的篩檢試驗(yàn)氧化酶分辨革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科及弧菌科（氧化酶陽性）兩類細(xì)菌觸酶分辨葡萄球菌和鏈球菌沙門氏菌有動力（除雞-雛沙門菌

）大多產(chǎn)硫化氫（除甲型副傷寒）產(chǎn)酸大多產(chǎn)氣（除傷寒、雞-雛沙門菌

）靛基質(zhì)-蔗糖-乳糖-甘露醇+葡萄糖+符合腸桿菌科特征初步生化:三糖鐵（TSI）現(xiàn)象說明底層黃色葡萄糖陽性紅色或不變色葡萄糖陰性黑色產(chǎn)H2S氣泡產(chǎn)氣斜面黃色乳糖和（或）蔗糖陽性紅色或不變色乳糖和（或）蔗糖陰性沙門氏菌血清凝集：A-F多價OH1H2如生化結(jié)果為沙門菌屬但A-F多價陰性考慮Vi抗原遮蔽，煮沸后再凝亞利桑那菌：遲緩發(fā)酵乳糖，延長平板培養(yǎng)時間可能使A-F以外的沙門菌可能是血清交叉凝集的檸檬酸桿菌結(jié)果報告方式A群：甲副1,2,12;aB群：乙型副傷寒1,4,5,12：b:1,2

鼠傷寒1,4,5,12：i:1,2C群：丙型副傷寒6,7，vi:c:1,5

豬霍亂6,7：c:1,5D群：腸炎沙門菌菌1,9,12：g,m

傷寒沙門菌1,9：vi:d志賀氏菌無動力，乳糖-（除宋內(nèi)遲緩發(fā)酵乳糖）不產(chǎn)硫化氫，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（除F6）靛基質(zhì)多數(shù)陽性（宋內(nèi)-）甘露醇+（痢疾志賀-）如生化結(jié)果為志賀氏菌屬，四種多價不凝K抗原遮蔽，煮沸后再凝EIEC補(bǔ)充生化ONPG產(chǎn)氣試驗(yàn)等志賀氏菌宋內(nèi)的R相，使用R相血清凝集蜂窩哈夫尼亞菌，做大生化鑒定類志賀鄰單胞菌動力氧化酶試驗(yàn)細(xì)菌革蘭氏染色形態(tài)常用快速檢測技術(shù)顯色培養(yǎng)基利用細(xì)菌專有酶進(jìn)行快速篩選沙門、金葡、大腸、弧菌、單增等3M測試片細(xì)菌微量快速鑒定（手工API）標(biāo)準(zhǔn)化，縮短檢測時間自動生化鑒定：AMSATBBioLog直接從標(biāo)本中檢測抗原——ELISA放免分析（RIA)酶免分析（EIA)化學(xué)發(fā)光（CIA)生物發(fā)光VIDAS膠體金技術(shù)細(xì)菌毒力基因快速檢測比細(xì)菌培養(yǎng)方法更可靠ETECLT(熱敏毒素）ST（耐熱毒素）EHECVT/SLT副溶：TDH金葡：腸毒素BAXIQ-Check普通PCR熒光定量PCR（實(shí)時、多重PCR）

常見食物中毒病原菌

病原菌致病機(jī)理特征食品標(biāo)本沙門菌組織侵襲禽、蛋、肉（交叉污染的進(jìn)口物）食品：血清分型培養(yǎng)病例：血清分型培養(yǎng)食品加工者：糞便、血清培養(yǎng)副溶血弧菌侵襲性腸毒素海產(chǎn)品食品／病例埃希氏大腸菌⒈產(chǎn)毒大腸桿菌腸毒素（STLT）生蔬菜食品：培養(yǎng)和血清分型病例：便培養(yǎng)、血清分型