紫外可見光譜與熒光光譜課件

紫外-可見光譜與熒光光譜分析方法2009-4-3主要內(nèi)容光譜產(chǎn)生的原理光譜儀的基本構(gòu)造光譜分析的應(yīng)用光譜儀的操作方法光譜的產(chǎn)生：輻射躍遷－光吸收和光發(fā)射分子的電子光譜：通過光與分子的相互作用，基態(tài)分子吸收光躍遷到電子激發(fā)態(tài)和電子激發(fā)態(tài)發(fā)射光躍遷到基態(tài)的光物理過程吸收光譜發(fā)射光譜（紫外－可見吸收光譜）（熒光光譜、磷光光譜）分子的電子吸收光譜和電子發(fā)射光譜為電子激發(fā)態(tài)的結(jié)構(gòu)、能學(xué)和動態(tài)學(xué)的研究提供了重要的信息圖：電磁波（一個小的有機分子的“尺寸”比一個波長要小得多）作為電磁波：可對帶電粒子（例如電子與核）和磁偶極子（如電子自旋和核自旋）施加電力和磁力光是一種電磁波，可以看成是由在光傳播方向上互相垂直的兩個平面上相互作用的交變電場與交變磁場組成的。光與分子的相互作用看作是振蕩偶極子（電子）和輻射場（振蕩電場）產(chǎn)生的一種能量交換過程。偶極子理解光與分子相互作用的關(guān)鍵概念是：光的振蕩電場可以使電子運動，也就是被激發(fā)的電子表現(xiàn)得象是一個振蕩的偶極子。這種偶極子的振蕩相當(dāng)于化學(xué)鍵中的電子相對于物質(zhì)中帶正電的原子核的運動，也就是電子圍繞分子的核骨架振動。在分子的電子云中任一給定點，光波引起的電場強度變化將是時間的函數(shù)即：零→（吸引）最大值→零→（產(chǎn)生一個相反的場）→（排斥）最大值→零重合（正、負電中心）分開圖：電場誘導(dǎo)產(chǎn)生偶極矩＋－＋δ＋δ－δ－δε＝0ε≠0μiμi凈效應(yīng)：瞬時偶極矩偶極矩電子躍遷所處的波長范圍（能量）電子躍遷類型：（1）σ→σ*躍遷指處于成鍵軌道上的σ電子吸收光子后被激發(fā)躍遷到σ*反鍵軌道（2）n→σ*躍遷指分子中處于非鍵軌道上的n電子吸收能量后向σ*反鍵軌道的躍遷（3）π→π*躍遷指不飽和鍵中的π電子吸收光波能量后躍遷到π*反鍵軌道。（4）n→π*躍遷指分子中處于非鍵軌道上的n電子吸收能量后向π*反鍵軌道的躍遷。（2）光吸收與光發(fā)射光譜相關(guān)的一些基本概念你做過吸收和發(fā)射光譜嗎？你為什么要做吸收和發(fā)射光譜？你理解的吸收和發(fā)射光譜是什么？吸收光譜與測試一個基態(tài)分子M吸收能量為h的一個光子，使占據(jù)軌道的一個電子躍遷到空軌道而處于電子激發(fā)態(tài)M*，這種光激發(fā)過程可表示為M＋hM*

通過吸收光譜的測定，可以確定與躍遷相關(guān)的兩個軌道的能級間隔。

:摩爾消光系數(shù)。是評價物質(zhì)吸收光的能力的重要物理量I0:入射光強度I:透射光強度是分子的一個基本性質(zhì)，與物質(zhì)的種類和入射光的波長有關(guān),不依賴于濃度和光程長度。其大小與躍遷是否滿足選擇定則密切相關(guān).Lambert定律指出：被透明介質(zhì)所吸收的入射光的百分數(shù)與入射光的強度無關(guān)。（激光光源除外）Beer定律指出：被吸收的光的量正比于光程中吸光分子的濃度。Lambert－Beer定律I=I010clA=log(I0/I)=cl（稀溶液）A：吸光值(2)能量吸收光譜通常用吸收光的波長λ(nm)、波數(shù)?(cm1)或光子能量(eV)表示激發(fā)態(tài)能量。波長通常用峰值波長λmax(nm)，有時也可采用帶邊波長λedge(nm)表示。波長、波數(shù)和eV之間能量換算關(guān)系如下：

?(cm1)=1/λ(cm)=1×107/λ(nm)

E(eV)=1240/λ(nm)OD=log(I0/I)(1)吸光度(absorbance)或光密度(opticaldensity)OD=2=0.011%transmitanceor99%absorbance~98%transmitanceor2%absorbance吸收光譜用峰值的ε值或者用譜帶的積分強度表示吸收強度。用于表示這種積分強度的物理量是振子強度(oscillatorstrength)：

=4.32

109∫d

4.32×109max

1/2

式中max為峰值摩爾消光系數(shù)，1/2為半峰寬。積分吸收強度與描述電子躍遷的基本理論單位振動強度有關(guān)，最大允許的躍遷強度的數(shù)值為1。應(yīng)用這個方程式可以計算任何一個吸收帶的振動強度，并且可以將這個計算至與1比較，來判斷產(chǎn)生這一能帶的電子躍遷是允許的還是禁阻的。紅移和藍移有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLλmax和吸收強度發(fā)生變化:

λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移

(或紫移)。吸收強度即摩爾吸光系數(shù)ε增大或減小的現(xiàn)象分別稱為增色效應(yīng)或減色效應(yīng)，如圖所示。吸收光譜的測定裝置示意圖:光源發(fā)射的多波長連續(xù)光經(jīng)過單色儀分光，按波長順序進入樣品池，透過樣品池的透射光用光電倍增管和光子計數(shù)器測定強度，用計算機控制操作并處理數(shù)據(jù)。在雙光路系統(tǒng)中，一個光路上為溶劑池，另一個光路上為樣品池，經(jīng)過單色儀的單色光交替透過兩個吸收池測得log(I0/I)隨波長的變化。

吸收光譜儀雙光路分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)機械轉(zhuǎn)動P使單色光以從長波到短波波長順序連續(xù)通過出射狹縫(S2)長波區(qū)：鎢燈（340－2500nm）短波區(qū)：氘燈（185－360nm）石英棱鏡反射鏡樣品池參比池光電倍增管（PbS光電池長波）光致電子激發(fā)態(tài)是很活潑的可以經(jīng)過分子內(nèi)輻射與無輻射躍遷回到基態(tài)，還可以與猝滅劑進行分子間能量轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移和化學(xué)反應(yīng)而猝滅。

？發(fā)射光譜與測試熒光光譜法基本原理

分子的激發(fā)與失活分子的多重態(tài)單重態(tài)：

一個所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。三重態(tài)：

有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。Jablonskidiagram發(fā)射光譜磷光光譜熒光光譜無輻射躍遷☆振動弛豫：☆內(nèi)轉(zhuǎn)換：☆系間竄越：☆外轉(zhuǎn)換：熒光磷光激發(fā)光譜和熒光光譜

熒光光譜的特點：①斯托克斯位移（Stokesshift)。與激發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長總是出現(xiàn)在更長的波長處；②熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)。無論用λ=250和350nm作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；③吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對稱。Em：

ex＋20——2ex－20Ex：em/2＋20——em－20（3）吸收光譜和發(fā)射光譜的形狀ΔE＝hν你所見到的吸收光譜和發(fā)射光譜:“銳線”?為什么不是與吸收的光或發(fā)射的光的頻率有關(guān)的“銳線”?1化合物的初步鑒定

利用紫外光譜可以推導(dǎo)有機化合物的分子骨架中是否含有共軛結(jié)構(gòu)體系，如C＝C－C＝C、C＝C－C＝O、苯環(huán)等。利用紫外光譜鑒定有機化合物遠不如利用紅外光譜有效，因為很多化合物在紫外沒有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光譜一般比較簡單，特征性不強。利用紫外光譜可以用來檢驗一些具有大的共軛體系或發(fā)色官能團的化合物，可以作為其他鑒定方法的補充。

如果一個化合物在紫外區(qū)是透明的，則說明分子中不存在共軛體系，不含有醛基、酮基或溴和碘。可能是脂肪族碳氫化合物、胺、腈、醇等不含雙鍵或環(huán)狀共軛體系的化合物。如果在210～250nm有強吸收，則可能含有兩個雙鍵的共軛體系，如共軛二烯或α，β-不飽和酮等。同樣在260，300，330nm處有高強度吸收帶，在表示有三個、四個和五個共軛體系存在。如果在260～300nm有中強吸收（ε＝200～1000），則表示體系中可能有苯環(huán)存在。如果苯環(huán)上有共軛的生色基團存在時，則ε可以大于10000。如果在250～300nm有弱吸收帶則可能含有簡單的非共軛并含有n電子的生色基團，如羰基等。

2純度檢測如果有機化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強的吸收，則可利用紫外光譜檢驗化合物的純度。如果有機化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強的吸收，則可利用紫外光譜檢驗化合物的純度。

在相同條件下配制樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳波長λ最佳處測得二者的吸光度A樣和A標(biāo)，進行比較，按式計算樣品溶液中被測組分的濃度。2.1比較法2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在λ最佳處分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在完全相同的條件下測定試液的吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試液的濃度。該法適用于大批量樣品的測定。

3定量分析朗伯-比爾定律朗伯-比爾定律是紫外-可見吸收光譜法進行定量分析的理論基礎(chǔ)，它的數(shù)學(xué)表達式為:

A=εlc4氫鍵強度的測定

溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時，對溶質(zhì)分子的UV光譜有較大的影響。對于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中吸收帶的差別，可以近似測定氫鍵的強度。溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時，對溶質(zhì)分子的UV光譜有較大的影響。對于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中吸收帶的差別，可以近似測定氫鍵的強度。

紫外/可見光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用濃度測定

構(gòu)象變化研究

相互作用研究蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收肽鍵在<250nm的遠紫外區(qū)有較大吸收蛋白質(zhì)濃度測定190nm10000l/mol.cm

190nm比280nm大~100倍

但溶劑吸收也較大溶劑的吸收蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜1mM0.1mM0.1mM二硫鍵在250nm附近有弱吸收色氨酸酪氨酸苯丙氨酸確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測蛋白質(zhì)的消光系數(shù)

ProtParam:Tyr的吸收譜與pH有關(guān)pHtitrationcanbeusedtodetermine

-whetherTyrisinternalorexternal

-polarityofenvironmentmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究AbsorptionspectraofPoly-L-LysHCl:randomcoilatpH6.0,25oC(bold);-HelixatpH10.8,25oC(dotted);-strandatpH10.8,52oC(dashed).蛋白質(zhì)折疊/變性研究核糖核酸酶熒光法的應(yīng)用熒光法靈敏度高，檢測限比吸收光譜法低1~3個數(shù)量級，可用于痕量分析。選擇性好，由于能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多。線性范圍寬。應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因為有的分子不發(fā)熒光。EnvironmentalSensitivityFluorophorescanbeaffectedbyalargenumberofenvironmentalfactorsincludingsuchparametersaspH,ionicstrength,non-covalentinteractions,lightintensity,temperatureandsoon.

Boththeexcitationandemissionwavelengthsandthequantumyieldcanallbechangedbyenvironmentalfactors.溫度熒光一般隨溫度上升而減弱熒光實驗需要恒溫ProteinintrinsicfluorescenceTrpfluorescencecanbeselectivelyexcitedat295-305nm.(toavoidexcitationofTyr)

Trpfluorescence

isverysensitivetoitslocalenvironmentItispossibletoseechangesinemissionspectrainresponseto

conformationalchanges,subunitassociation,substratebinding,denaturation,

andanythingthataffectsthelocalenvironmentsurrondingtheindolering.Also,Trpappearstobeuniquely

sensitivetocollisionalquenching,

eitherby

externallyaddedquenchers,orby

nearbygroupsintheprotein.FluorescenceoftryptophandependsuponthedipolarnatureofthesolventCa-parvalbumin:tryptophanisburied,305nmCa-freeparvalbumin:tryptophanisexposedtosolventTryptophaninvarioussolvents:hexane,trehaloseglass,glycerol,waterFluorescencespectralshiftscanbeverylarge序號儀器名稱購置日期單價管理者銷售商運行狀況配件維修記錄205301熒光2004.11178200.00吳曉霞島津沈陽辦良好恒溫水浴無21紫外分光光度計2000.12113781.00吳曉霞島津沈陽辦良好無22P-750熒光2000.12117943.00吳曉霞日本分光3換工作站無232550紫外2004.11341550.00吳曉霞島津沈陽辦良好半導(dǎo)體元件242550紫外2007.1168000.00吳曉霞島津沈陽辦良好恒溫水浴無251700紫外2004.11吳曉霞島津沈陽辦良好無261700紫外2004.11吳曉霞島津沈陽辦良好無儀器的操作方法一、開機前準(zhǔn)備

1．實驗室溫度應(yīng)保持在15℃~30℃之間，相對濕度應(yīng)保持在45%~80%之間。

2．確認樣品室內(nèi)無樣品。

二、開機

1．開啟總電源及UV-2550電源。

2．開啟計算機電源，雙擊桌面上的UVProbe圖標(biāo)進入操作系統(tǒng)。

3．在UVProbe界面上點擊[Connect]鍵，聯(lián)機并初始化。整個過程需花4~5分鐘。（電源再次打開時，需隔10分鐘或更長的時間。）SHIMADZUUV-2550型紫外可見分光光度儀操作規(guī)程三、操作過程

1．在主菜單上選擇測定的方式：

（1）點擊[Kinetics]鍵進入動力學(xué)測定方式：一般測定吸收值隨時間的變化，通常用于酶反應(yīng)隨時間的變化。

（2）點擊[Spectrum]鍵進入光譜測定方式：可進行紫外可見近紅外區(qū)的光譜測定。（3）點擊[Photometric]鍵進入光度測定（定量）方式：可進行多波長、單波長、峰高定量。校準(zhǔn)曲線可使用多點、單點、K因子等方法。

2．參數(shù)的設(shè)定：點擊菜單欄上的[M]鍵，點擊［Measurement］標(biāo)簽，根據(jù)提示在對話框中選擇波長測定范圍、掃描速度、采樣間隔等參數(shù)；點擊［InstrumentParameters］標(biāo)簽，選擇測定種類（吸收值、透射能量、反射率）及通帶（狹縫）等條件。

3．基線校正：所有參數(shù)設(shè)置完成后，兩個樣品架均不放置樣品或兩個均放上同樣的空白溶液，點擊“Baseline”，開始進行基線校正，儀器掃描完成后，點擊“λGoToWL”將波長轉(zhuǎn)到800nm，點擊“AutoZero”把800nm的波長設(shè)為0。點擊“Start”再次掃描，若得出曲線值均小于0.001，則認為基線平坦，若數(shù)值較大，則將800nm吸光度設(shè)為0重新進行基線掃描。

4．樣品測定：樣品放入樣品室后，點擊[Start]鍵即開始測定。完成后，取一個文件名并保存。四、報告輸出

點擊菜單欄上的[Report]鍵，根據(jù)需要選擇報告格式。點擊菜單欄上的[Printpreview]鍵預(yù)覽，點擊菜單欄上的[Print]鍵，輸出報告。

五、關(guān)機

1．在UVProbe界面上點擊[Disconnect]鍵，退出操作系統(tǒng)，并取出樣品池。

2．關(guān)閉UV-2550主機，關(guān)閉計算機、打印機、總電源。

3．在記錄本上記錄本次使用情況。

六、注意事項

樣品池內(nèi)溶液不要超過池容積的4/5，樣品池放入樣品室前外部用軟紙擦干。

注意事項1.光度計燈源壽命有限，若長時間不測量，應(yīng)通過UVProbe軟件斷開連接（點擊“Disconnect”），然后關(guān)閉光度計電源。2.使用分光光度計時要保證樣品室絕對干凈，小心放入樣品，放入比色皿前一定要先用濾紙和擦鏡紙將比色皿外表面擦干凈，不要污染樣品池和光度計外表面。3.儀器自檢和掃描的過程中，不要打開樣品室蓋。4.軟件不會自動保存數(shù)據(jù)，所有的數(shù)據(jù)要保存都必須點擊“Save”或者“SaveAs”進行另存。否則數(shù)據(jù)會丟失。光譜1.打開計算機和RF-5301PC熒光分光光度計開關(guān)。Windows啟動后，雙擊RF-530XPC，自檢。2.從“AcquireMode”菜單中選擇[Spectrum]進入Spectrum模式。(1)從另外的數(shù)據(jù)獲取模式中進入Spectrum，會自動顯示光譜參數(shù)對話框。(2)如果當(dāng)前模式已經(jīng)是Spectrum模式，從“Configure”菜單中選擇[Parameters],可顯示SpectrumParameters對話框。（如圖1）

RF-5301PC型熒光分光光度計使用方法SpectrumParametersSpectrumType:○Excitation⊙Emission○SynchronousExWavelength:350nmEMWavelengthRange:Start370

End680RecordingRange:Low0.000High50.000ScanningSpeed:MediumSamplinglnterval(nm):0.2Slitwidth(nm):EX5EM5Sensitivity:⊙High○LowResponseTime[sec]:AutoRepeatScan…AutoFile…OKCancel

圖13.確定所有參數(shù)后點擊OK。4.將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點擊<START>開始掃描。5.掃描結(jié)束后，會出現(xiàn)對話框，這時輸入文件名。將光標(biāo)移至Comment文本框，輸入注釋。點擊<SAVE>，將數(shù)據(jù)保存。6.點擊鼠標(biāo)右鍵，會出現(xiàn)一個菜單，選擇[Radar]，從副菜單中選擇[BothAxes]，自動建立新的圖形限制。7.如果想擴大光譜上某一特定區(qū)域，用鼠標(biāo)點此區(qū)域的左上角，并拖動鼠標(biāo)至我們想要擴大的區(qū)域范圍?；蛘邚暮衃Rader]的相同菜單中選擇[Limit]（點擊鼠標(biāo)右鍵），設(shè)定新的圖形限制，在出現(xiàn)的對話框中輸入上限及下限。8.點擊鼠標(biāo)右鍵，讀取鼠標(biāo)所指位置的波長及熒光強度。之后選擇[CrossHair]→[Display]。9.移動鼠標(biāo)所指區(qū)至想要的位置。10.選擇Display刪除鼠標(biāo)所指區(qū)域。11.在File菜單中選擇Save，儲存獲得的數(shù)據(jù)。定量分析1.從“AcquireMode”菜單中選擇[Quantitative]，進入Quantitative模式，會自動顯示Quantitative參數(shù)對話框。2.按圖2所示確定獲得參數(shù)當(dāng)在method下方選擇“MultiPointWorkingCurve”時，會出現(xiàn)MultiPointCurve對話框。按圖3所示進行選擇。QuantitativePeramelersMethod:ConcentrationMultipointWorkingCurveUnits:ppbEXWavelength:350.0Range:0.000to100.00EMWavelength:450.0

RecordingRangeSlitWidth[nm]:EX5EM5Low0.000High1000.00Sensitivity:⊙High○LowResponseTime:Auto□AutoScanModeRepetitions:1

OKCancel圖2MultipointWorkingCurveOrderofCurve…⊙Ist○2nd○3rdZerolnterception…○yes⊙NoOKCancel圖33.確定所有參數(shù)后點擊<OK>鍵。4.將裝有空白樣品的樣品池放入池槽中，點擊<AutoZero>設(shè)定零點。5.將第一個標(biāo)準(zhǔn)樣裝入池槽中并點擊<Read>，會出現(xiàn)StandardSampleDataEdit對話框。輸入標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度值并點擊<OK>鍵。6.重復(fù)第五步繼續(xù)處理第二個標(biāo)準(zhǔn)樣。一旦獲得了足夠多的標(biāo)準(zhǔn)樣數(shù)據(jù)，在屏幕上便會自動出現(xiàn)工作曲線。點擊鼠標(biāo)右鍵，在出現(xiàn)的菜單中選擇[Rader]→[BothAxes]，便可自動繪圖。7.在工作曲線繪制完成后，可定量確定未知樣的濃度。點擊<Unknown>鍵，出現(xiàn)UnknownAvquisition屏幕。8.將裝有未知樣品的池放入池槽中，點擊<Read>開始濃度的定量測定。9.在File菜單中選擇Save，儲存獲得的數(shù)據(jù)。10.在出現(xiàn)的對話框中輸入標(biāo)準(zhǔn)樣和未知樣的文件名，點擊<OK>鍵。時間程序1.從“AcquireMode”菜單中選擇[TimeCourse]，進入TimeCourse數(shù)據(jù)獲取模式，會自動顯示TimeCourse參數(shù)對話框。2.按圖4所示確定獲得參數(shù)。3.確定所有參數(shù)后點擊<OK>鍵。4.將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點擊<AutoZero>設(shè)定零點。以下步驟是基于時間進程數(shù)據(jù)是在菡餾水的Raman峰的基礎(chǔ)上獲得的假設(shè)。5.點擊Start鍵開始收集數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)收集完之后，出現(xiàn)對話框，輸入獲得的數(shù)據(jù)的文件名。移動光標(biāo)至文本框，輸入注釋。當(dāng)所有輸入完成后，點擊<Save>保存數(shù)據(jù)，若點擊<Discerd>，所有輸入的數(shù)據(jù)將丟失。6.從File菜單重選擇<Save>，儲存獲得的數(shù)據(jù)。TimeCourseParemetersEXWavelength:350.0RecordingRangeEMWavelength:397.0Low:-5High:5SlitWidth(nm):EX5EM5Sensttivity:⊙High○