分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第一頁，共十四頁，2022年，8月28日基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。

利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中,可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部,從而達(dá)到提取的目的。

在提取過程中,染色體會發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩,以保證得到較長的DNA。一般來說,構(gòu)建基因組文庫,初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析,DNA長度可短至50kb,在該長度以上,可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。第二頁，共十四頁，2022年，8月28日不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法,以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí),應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)以動物肝臟為材料,學(xué)習(xí)基因組DNA提取的一般方法。第三頁，共十四頁，2022年，8月28日提純的思路基因組DNA的特性：分子量較大、易斷（如何保證DNA分子的完整性？）2.組織和細(xì)胞的破碎3.要去除的物質(zhì)：蛋白、多糖、脂類、RNA和小分子物質(zhì)

第四頁，共十四頁，2022年，8月28日一、材料

哺乳動物新鮮組織。二、設(shè)備移液管高速冷凍離心機(jī)臺式離心機(jī)水浴鍋。第五頁，共十四頁，2022年，8月28日三、試劑：1.組織勻漿液200mL滅菌備用

10mmol/LTris-HClpH8.025mmol/LEDTA100mmol/LNaCl2.酶解液100mL（滅菌后再加蛋白酶K和SDS)20mmol/LTris-HClpH8.050mmol/LEDTA200mmol/LNaCl200ug/mL蛋白酶K1％SDS第六頁，共十四頁，2022年，8月28日3.生理鹽水(0.7%)1000mL滅菌備用4.3mol/LNaAcpH5.2100mL滅菌備用先用50mL水溶解固體NaAc再用3mol/L乙酸調(diào)pH至5.2，最后定容同時(shí)滅菌備用：槍頭：1mL、200uL各一盒小指管:2.0、0.5mL各20個(gè)研磨棒:20支無菌水：250mlX2瓶第七頁，共十四頁，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)步驟

基因組DNA的提?。?.2g鼠肝，冰冷生理鹽水洗3次，剪碎加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL勻漿液混勻勻漿液轉(zhuǎn)入2mL小指管，40C,5000rpm離心2min,沉淀加0.4mL無菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢顛倒混勻550C水浴酶解過夜或2小時(shí)以上，40C存放第八頁，共十四頁，2022年，8月28日（加RNase,終濃度200ug/mL，370C保溫60min）加等體積酚/氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻，冰上平倒靜置10-20min40C，10000rpm離心10min，用擴(kuò)口槍頭取出上清上清加等體積氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻40C,10000rpm，用擴(kuò)口槍頭取上清第九頁，共十四頁，2022年，8月28日上清加1/10體積的NaAc和加2倍體積的無水乙醇慢慢混勻沉淀DNA，-200C靜置30min，DNA沉淀形成白色絮狀物。

12000rpm離心15min，棄上清沉淀用1mL75%冷乙醇洗兩次，每次12000rpm離心10min，棄上清超凈臺中干燥加50uLTE,40C溶解過夜，-200C保存第十頁，共十四頁，2022年，8月28日基因組DNA的檢測前述方法得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA產(chǎn)量及質(zhì)量均不同,有時(shí)DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì),會影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1.DNA溶液稀釋20-30倍后,測定OD260/OD280比值,明確DNA的含量和質(zhì)量。(☆)

2.取2-5μl在0.7%agarose膠上80V電泳,檢測DNA的分子大小。(☆)

3.取2μgDNA,用10單位(U)HindⅢ酶切過夜,0.7%agarose膠上電泳,檢測能否完全酶解(做RFLP,DNA必須完全酶解)。第十一頁，共十四頁，2022年，8月28日如果DNA中所含雜質(zhì)多,不能完全酶切,或小分子DNA多,影響接續(xù)的分析和操作,可以用下列方法處理：（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。（2）酚:氯仿抽提,去除蛋白質(zhì)和多糖。（3）Sepharose柱過濾,去除酚類、多糖和小分子DNA。（4）CsCl梯度離心,去除雜質(zhì),分離大片段DNA(可用作文庫構(gòu)建)。第十二頁，共十四頁，2022年，8月28日可能的結(jié)果：由于基因組DNA比較難溶、且容易被降解，電泳時(shí)經(jīng)常會出現(xiàn)彌散的或不均一的條帶（如左圖）。所以實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要注意機(jī)械