生物檢測技術(shù)(多抗和單抗)

三、半抗原免疫原的制備1.半抗原（hapten)

：僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)低分子量的化學(xué)物質(zhì)。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、某些藥物(包括抗生素）及其他化學(xué)物品等。2.載體(carrier)：賦予半抗原以免疫原性的物質(zhì)；蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大聚合物；第一節(jié)半抗原免疫原的制備當(dāng)前1頁，總共75頁。

載體類型

1.蛋白質(zhì)：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。載體類型2.多肽聚合物：人工合成的，常見的有多聚賴氨酸，其分子量大（可達十幾萬到幾十萬)，這種多聚物和半抗原結(jié)合后，可刺激免疫動物產(chǎn)生高效價、高親和力的抗體。3.大聚合物：羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，可與半抗原結(jié)合，加入弗氏完全佐劑亦可誘發(fā)動物產(chǎn)生抗體。當(dāng)前2頁，總共75頁。①物理方法：利用通過電荷和微孔吸附半抗原吸附的載體有羧甲基纖維素（CMC）、聚乙 烯吡咯烷酮（PVP）、硫酸葡聚糖等3、半抗原與載體的連接方法②化學(xué)方法：利用某些功能基團將半抗原連接到載體上帶有游離氨基或羧基以及兩種基團都有的半抗原：碳二亞胺法

戊二醛法

混和酸酐法不帶氨基和羧基的半抗原：用化學(xué)方法使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，再與載體連接---琥珀酸酐—碳二亞胺法當(dāng)前3頁，總共75頁。第二節(jié)、多克隆抗體（polyclonalantibody,PcAb）將由多種抗原成分組成的抗原物質(zhì)，采用傳統(tǒng)方法免疫接種實驗動物后采集免疫血液，分離所得到的抗血清即為多克隆抗體。當(dāng)前4頁，總共75頁。

抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動物，該動物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個B細胞克隆被激活并產(chǎn)生針對某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體。當(dāng)前5頁，總共75頁。免疫血清的制備1.免疫動物選擇2.免疫方法3.動物采血法4.免疫血清的分離及保存

當(dāng)前6頁，總共75頁。能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。1.抗原與免疫動物種屬差異越遠越好。2.動物必須適齡、健壯、無感染。3.動物體內(nèi)有與抗原相類似的物質(zhì)或其它原因而使該抗原對該動物免疫原性極差，則該動物不能選用。例如：IgE–綿羊，胰島素-家兔，酶類-山羊等。4.抗血清的用量5.抗血清的要求：例如，馬型抗血清用于沉淀反應(yīng)時較難掌握，因而極少應(yīng)用。一、免疫動物選擇當(dāng)前7頁，總共75頁。常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產(chǎn)抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：酶類免疫常用。當(dāng)前8頁，總共75頁。3.免疫方案①全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注射②微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐劑1月抗原③混合免疫法：綜合皮下、淋巴結(jié)和靜脈二、免疫方法1.免疫原的注射劑量

大:0.5~1mg/只，小:0.1~0.6mg/只2.免疫途徑：免疫反應(yīng)產(chǎn)生速度依次為靜脈＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮內(nèi)＞淋巴結(jié)＞足掌當(dāng)前9頁，總共75頁。免疫間隔時間

第一次和第二次間隔10～20天，三次及以后間隔7～10天；當(dāng)前10頁，總共75頁。采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。(1)頸動脈采血法;最常用的方法，家兔、山羊等動物；(2)心臟采血法;用于豚鼠、大鼠、雞等小動物，要求操作熟練，(3)靜脈采血法;家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈；

三、動物采血法當(dāng)前11頁，總共75頁。四、免疫血清的分離和保存1、收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。2、56℃30min滅活在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml）；當(dāng)前12頁，總共75頁。1.4℃保存：可保存3～6個月2.低溫保存：-20～-40℃，可保存2～3年3.冰凍干燥保存：可保存3～5年四、免疫血清的分離和保存當(dāng)前13頁，總共75頁。多抗的純化與鑒定

抗原免疫動物制備的抗血清是成分復(fù)雜的混合物，除含有特異性抗體外，還存在與目的抗體不相關(guān)的成分。純化目的是除去這些不相關(guān)成分，防止抗血清中其他雜抗體干擾試驗結(jié)果。當(dāng)前14頁，總共75頁。鹽析法（硫酸銨沉淀)辛酸-硫酸銨沉淀法離子交換法親和層析法凝膠過濾法當(dāng)前15頁，總共75頁。1、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下，蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀；硫酸銨是最常用的中性鹽;不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同;硫酸銨的加入量通常以飽和度表示;(100%飽和度:767g/L)當(dāng)前16頁，總共75頁。主要步驟在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀；4℃高速離心,棄上清,溶解沉淀；可反復(fù)操作,逐級降低硫酸銨的濃度:50%飽和度:0.313g/ml45%飽和度:0.277g/ml40%飽和度:0.243g/ml最后一次離心后,用少量PBS溶解沉淀,透析,測定濃度。當(dāng)前17頁，總共75頁。特點成本低，步驟簡單?？贵w的回收率比較高?？贵w純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適合于做各種標(biāo)記。需要高速離心機。當(dāng)前18頁，總共75頁。2、正辛酸-硫酸銨沉淀法原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白:正辛酸是一種有機酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀。當(dāng)前19頁，總共75頁。主要步驟：①血清濾紙過濾去沉淀和脂質(zhì)，濾液用4倍體積60mmo1/L醋酸緩沖液(pH4.0)稀釋后，用Na0H調(diào)，PH值至4.5。②逐滴加入辛酸(終濃度25u1/ml)，室溫h攪拌30分鐘后，以6000-8000r/min.離心30分鐘，收集上清液。③上清液經(jīng)濾紙過濾2次，將濾液與10*PBS(0.lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，調(diào)pH至7.4,置冰浴冷至40度。④每毫升上述混合液加0.2778固體硫酸錢，40度攪拌30分鐘，以4000-6000r/min離心巧一20分鐘，將沉淀溶于少量YBS，透析，測蛋白含量，凍存。當(dāng)前20頁，總共75頁。特點成本較低，步驟較復(fù)雜?？贵w回收率很低?？贵w純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標(biāo)記。需要高速離心機，耐高速離心的玻璃離心管。當(dāng)前21頁，總共75頁。3、離子交換法原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進行物質(zhì)分離；DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷

(Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)；將樣品的pH值調(diào)至等電點以上,使樣品帶負電荷；采用鹽溶液洗脫,通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分。當(dāng)前22頁，總共75頁。+++++--------

帶負電荷的被吸附上帶負電荷少的先被置換帶負電荷多的后被置換當(dāng)前23頁，總共75頁。NaClTris

梯度混合儀連續(xù)梯度洗脫:當(dāng)前24頁，總共75頁。

階段洗脫:T離子強度蛋白濃度T倒入一定濃度的NaCl溶液通過離心來分離當(dāng)前25頁，總共75頁。主要步驟

先用硫酸銨沉淀抗體，粗提；將樣品過柱；洗去沒有結(jié)合的物質(zhì)；用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液；紫外分光光度計測量，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。當(dāng)前26頁，總共75頁。圖3在DEAE-纖維素上人血清蛋白的層析示意圖

(M=IgM,G=IgG,A=IgA)當(dāng)前27頁，總共75頁。特點成本較低，步驟較簡單。抗體回收率較高?？贵w純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動收集器。當(dāng)前28頁，總共75頁。4、親和層析法原理利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合（抗體-抗原，受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合,捕捉與它相配的物質(zhì)。洗脫一般采用改變pH值的方法當(dāng)前29頁，總共75頁。使用前樣品結(jié)合(Binding)洗脫(Elution)當(dāng)前30頁，總共75頁。主要步驟

將ProteinA與活化的柱子相結(jié)合(買商品柱)；將腹水或血清處理后過柱；用結(jié)合緩沖液洗柱子，直到A280值為零；用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液；測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。當(dāng)前31頁，總共75頁。

葡萄球菌A蛋白

(staphylococcalproteinA,SPA)金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白分子量42000,等電點pH5.1可與大多數(shù)動物Ig的Fc段結(jié)合一個SPA分子有4個相似的活性部位與IgG的結(jié)合最強,與IgM,IgA的結(jié)合較差當(dāng)前32頁，總共75頁。特點成本高，步驟較簡單?？贵w回收率低?？贵w純度高，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要自動收集器。當(dāng)前33頁，總共75頁。5、凝膠過濾法(分子篩)原理將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質(zhì),由于流經(jīng)路徑的差異,使不同分子質(zhì)量的組分分離.大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外通過，走得快；小分子物質(zhì)進入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來，走得慢。適合于IgM類抗體的純化

(五聚體,分子量約800KD)當(dāng)前34頁，總共75頁。當(dāng)前35頁，總共75頁。主要步驟將腹水或血清處理后上柱,樣品要濃；

(可用G-200，柱子要長，80-100cm)待樣品入柱后,用緩沖液過柱；等量收集洗脫液,測定洗脫液的A280值。收集第一峰。當(dāng)前36頁，總共75頁。凝膠過濾法純化抗體血清蛋白的分級分離常用凝膠過濾法進行，按分子大小可分為三組：第一組包括IgM和一些脂蛋白；第二組主要是IgG和較少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白；第三組主要白蛋白、血清粘蛋白、鐵傳遞蛋白等。當(dāng)前37頁，總共75頁。

在凝膠過濾柱上血清蛋白的層析示意圖

(M=IgM,G=IgG,A=IgA)當(dāng)前38頁，總共75頁。特點成本高，步驟較簡單?？贵w回收率較高，分離條件緩和，抗體活性不受影響?？贵w純度較高。需要自動收集器。當(dāng)前39頁，總共75頁。1.抗體效價的鑒定：即為抗體活性滴定特異性抗體的鑒定2.抗體特異性鑒定：

①細菌類抗原的抗體用凝集試驗②可溶性抗原的抗體用雙向瓊脂擴散試驗3.抗體的純度鑒定：免疫電泳分析法4.抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好當(dāng)前40頁，總共75頁。第三節(jié)單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）由單個B細胞增殖所產(chǎn)生的抗體，其遺傳背景完全一致，因此，抗體分子的氨基酸序列、類型、抗原特異性等生物學(xué)性狀均相同。應(yīng)用：高效治療劑（抗病毒）藥物導(dǎo)彈（McAb與毒素偶聯(lián)）（抗腫瘤）具有高特異性、高純度、效價高等優(yōu)點。當(dāng)前41頁，總共75頁。McAbandPcAb當(dāng)前42頁，總共75頁。淋巴細胞雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體：該技術(shù)由G.Kohler、C.Milstein于1975年創(chuàng)建，1984年獲諾貝爾獎。免疫B淋巴細胞×

骨髓瘤細胞（可分泌McAb，（在體外能長期繁殖）在體外不能長期繁殖）

細胞融合

雜交瘤細胞

（分泌McAb，長期繁殖）

生長繁殖

產(chǎn)生McAb當(dāng)前43頁，總共75頁。雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨髓瘤細胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體當(dāng)前44頁，總共75頁。流程當(dāng)前45頁，總共75頁。雜交瘤技術(shù)的原理及流程當(dāng)前46頁，總共75頁。

動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重動物免疫當(dāng)前47頁，總共75頁。細胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫方法當(dāng)前48頁，總共75頁。B淋巴細胞的分離免疫脾細胞的制備：1×10^8的淋巴細胞無菌手術(shù)制備；當(dāng)前49頁，總共75頁。常用的小鼠骨髓瘤細胞株為SP20、NS1；不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-;次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、胸腺嘧啶核苷激酶；與提供淋巴細胞的動物品系相同骨髓瘤細胞當(dāng)前50頁，總共75頁。當(dāng)前51頁，總共75頁。培養(yǎng)骨髓瘤細胞選擇對數(shù)生長期的細胞進行傳代培養(yǎng),細胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用8-氮鳥嘌呤（8-AG）處理細胞。注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中當(dāng)前52頁，總共75頁。細胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑；作用機理：誘導(dǎo)細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合；作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同；常用培養(yǎng)液：RPM1640或DMEM培養(yǎng)液；細胞融合當(dāng)前53頁，總共75頁。骨髓瘤細胞與B細胞(1:3)50%PEG1min內(nèi)加完;2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液細胞融合當(dāng)前54頁，總共75頁。1ml50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用；根據(jù)細胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液。細胞融合當(dāng)前55頁，總共75頁。致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞離心1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液

10ml離心1000rpm7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)當(dāng)前56頁，總共75頁。。飼養(yǎng)細胞當(dāng)前57頁，總共75頁。10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細胞的早期培養(yǎng)當(dāng)前58頁，總共75頁。雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA當(dāng)前59頁，總共75頁。B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細胞：壽命長雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體當(dāng)前60頁，總共75頁。當(dāng)前61頁，總共75頁。HAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷;HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻。當(dāng)前62頁，總共75頁。雜交瘤細胞：從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息；從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力；利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA,可長期生長繁殖；當(dāng)前63頁，總共75頁。隨機融合后的細胞類型細胞組合HGPRT生長狀態(tài)淋巴細胞+骨髓瘤+長期生長淋巴細胞+淋巴細胞+短期生長骨髓瘤+骨髓瘤—不能生長未融合淋巴細胞+短期生長未融合骨髓瘤—不能生長當(dāng)前64頁，總共75頁。有限稀釋法(limitingdilution)

顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存當(dāng)前65頁，總共75頁。特點：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.