病原學、免疫學及生化檢測

微生物是存在于自然界中的一群體形細小、結(jié)構(gòu)簡單、肉眼直接看不見、必須借助光學顯微鏡或電子顯微鏡放大幾百倍、幾千倍甚至幾萬倍才能觀察到的微小生物。當前1頁，總共52頁。使用油鏡時，需在玻片上滴加香柏油。這是因為油鏡的放大倍數(shù)較高，而透鏡很小，光線通過不同密度的介質(zhì)物體（玻片→空氣→透鏡）時，部分光線會發(fā)生折射而散失，進入鏡筒的光線少，視野較暗，物體觀察不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），則使進入油鏡的光線增多，視野亮度增強，物象清晰。當前2頁，總共52頁。一、微生物分類微生物雖然個體微小，但具有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，所以按其結(jié)構(gòu)和組成的差異分為三大類1、非細胞型微生物：體積微小，能通過濾菌器，只能在活細胞內(nèi)生長繁殖，如病毒、噬菌體；2、原核細胞型微生物：僅有原始核，無核仁和核膜，缺乏完整的細胞器，如細菌、放線菌、支原體、衣原體；3、真核細胞型微生物：細胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，胞質(zhì)內(nèi)有完整的細胞器，如霉菌、酵母菌、藻類等。當前3頁，總共52頁。二、細菌生長繁殖的條件1、充足的營養(yǎng)。水、碳源、氮源、無機鹽和生長因子。2、合適的酸堿度。大多數(shù)為中性或弱堿性，即PH7.2-7.6。個別細菌在較堿性的培養(yǎng)基中生長良好。3、適宜的溫度。分為嗜冷菌、嗜熱菌、嗜溫菌。4、必要的氣體環(huán)境。主要是氧與二氧化碳。當前4頁，總共52頁。三、細菌群體的生長繁殖分期1、遲緩期。此期中細菌體積增大，代謝活躍但不分裂，菌數(shù)并不增多。此期長短不一，從數(shù)小時到數(shù)天不等，視菌種、菌齡與接種菌量和營養(yǎng)物質(zhì)的不同而異。2、對數(shù)生長或指數(shù)期。此期中細菌生長迅速，以恒定的速度進行分裂繁殖，菌數(shù)以幾何級數(shù)增長，增長極快。研究細菌的性狀最好選用此期的細菌。3、穩(wěn)定期。對數(shù)期后，細菌繁殖速度逐漸下降，細菌繁殖數(shù)與死亡數(shù)幾近相等，活菌數(shù)保持穩(wěn)定。4、衰亡期?；罹鷶?shù)急劇減少。當前5頁，總共52頁。當前6頁，總共52頁。四、細菌的染色1、分為單染法、復染法、特殊染色法、負染色法、熒光染色體法等。單染法：只用一種染液，可顯示細菌的形態(tài)與排列，不能顯示細菌的結(jié)構(gòu)與染色反應的特性。原理：由于細菌在中性環(huán)境中一般帶負電荷，所以通常采用堿性染料如美藍、堿性復紅、結(jié)晶紫、孔雀綠、番紅等進行染色。這類染料解離后，染料離子帶正電荷，使細菌著色。當前7頁，總共52頁。復染法：用兩種以上不同顏色的染料進行染色，除可觀察細菌的形態(tài)、排列、大小外，還能將細菌染成不同的顏色。常用的革蘭氏染色法和抗酸染色法即為復染法。當前8頁，總共52頁。2、革蘭氏染色法2.1原理：依據(jù)的是細菌的細胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同，革蘭氏陽性菌的細胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)而成的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，經(jīng)乙醇處理發(fā)生脫水作用，使孔徑縮小，通透性降低，結(jié)晶紫與碘形成大分子復合物保留在細胞內(nèi)而不被脫色，結(jié)果使細胞呈現(xiàn)紫色。而革蘭氏陰性菌肽聚糖層薄，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少，而且類脂含量較高，經(jīng)乙醇處理后，類脂被溶解，細胞壁孔徑變大，通透性增加，結(jié)晶紫與碘的復合物被溶出細胞壁，因而細胞被染色，再經(jīng)番紅復染后細胞呈紅色。當前9頁，總共52頁。2.2試劑：2.2.1堿性染料草酸銨結(jié)晶紫液；2.2.2媒染劑碘液，其作用是增強染料與菌體的親和力，加強染料與細胞的結(jié)合；2.2.3脫色劑乙醇，將染料溶解，使被染色的細胞脫色。利用不同細菌對染料脫色的難易程度不同，而加以區(qū)分；2.2.4復染液番紅溶液，目的是使經(jīng)脫色的細菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進行比較。當前10頁，總共52頁。2.3操作過程標本經(jīng)固定后，先用結(jié)晶紫染色、再加碘液媒染、然后用乙醇脫色，最后用沙黃或復紅復染。2.4意義依據(jù)革蘭氏染色可將細菌分為陽性和陰性兩大類。由于陽性、陰性細胞壁等結(jié)構(gòu)上的差別可造成對抗生素的敏感性不同，臨床上依據(jù)此，可選擇性針對用藥。當前11頁，總共52頁。1.涂片固定2.單染—結(jié)晶紫染液第一次染色

1min

當前12頁，總共52頁。3.媒染—碘-碘化鉀溶液浸濕30S4.脫色—95%乙醇溶液進行顏色洗脫5.復染—紅色的藩紅染液第二次染色

當前13頁，總共52頁。2.5注意事項2.5.1制片是染色的關鍵，載片要清潔，不得沾污油脂，菌株才能涂布均勻。注意初次涂片時，取菌量不應過大，以免造成菌體重疊。2.5.2注意水流不得直接沖在涂菌處，以免將菌體沖掉。2.5.3脫色是革蘭氏染色的關鍵，必須掌握乙醇的脫色程度。若脫色過度則陽性菌被誤染為陰性菌，而脫色不夠時陰性菌被誤染為陽性菌。（拉絲試驗——未斷裂DNA螺旋）當前14頁，總共52頁。當前15頁，總共52頁。革蘭氏染色

1884年丹麥醫(yī)師Gram所發(fā)明當前16頁，總共52頁。紫色者為G＋菌，紅色者為G—菌細菌呈現(xiàn)第一次染色的效果紫色，革蘭氏陽性菌（紫陽G＋）；呈現(xiàn)第二次染色的效果紅色；稱革蘭氏陰性菌（紅陰G-）當前17頁，總共52頁。當前18頁，總共52頁。五、細菌的培養(yǎng)和分離大多數(shù)細菌可以用人工方法培養(yǎng)，但必須根據(jù)不同細菌采取各自適宜的條件，如無菌技術、接種和分離方法、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等1、樣品處理標本采集是否符合要求，直接影響細菌的檢測結(jié)果，因此要求除糞、痰、咽拭子等標本，其他樣本均應以無菌技術采集。標本盛于無菌容器內(nèi)，根據(jù)目的菌的種類采用不同的方法采集，標本采集后及時冷藏送檢。當前19頁，總共52頁。2、無菌技術2.1細菌學檢驗必須隨時防止污染和病原菌的擴散，為達到此目的而采取的技術就是無菌技術或無菌操作，在進行細菌培養(yǎng)檢查過程中，無論是標本采集或培養(yǎng)操作，均需嚴格執(zhí)行無菌操作技術。2.2所用器具、培養(yǎng)基等必須嚴格滅菌，使用過程中不得與未經(jīng)消毒物品接觸，忌長時間暴露于空氣手中，有蓋的應迅速蓋上。2.3滅菌的試管、玻璃等在打開蓋后及關閉前，口部應在火焰上通過1-2次，以殺滅可能從空氣中落入的雜菌；接種環(huán)或接種針每次使用前后，均應在火焰上燒灼滅菌，金屬棒或玻璃棒部分亦須轉(zhuǎn)動通過火焰3次。當前20頁，總共52頁。2.4進行細菌檢驗的全過程應在無菌室、接種罩或生物安全柜內(nèi)進行。2.5檢驗時忌用手接觸標本及已滅菌的器材內(nèi)部，也勿用口吹以防其他雜菌混入培養(yǎng)物中。2.6打開瓶塞及試管塞時，應將塞子上端夾持于手指間適當位置，不得將棉塞任意放置別處。當前21頁，總共52頁。3、接種、分離及結(jié)果觀察接種細菌應用接種環(huán)（針）來蘸取細菌標本，進行接種，其程序可分為：滅菌接種環(huán)冷卻蘸取細菌標本進行接種接種環(huán)滅菌5個程序。當前22頁，總共52頁。細菌的接種與分離技術

平板分區(qū)劃線法每劃完一區(qū)，要將接種環(huán)滅菌

2斜面接種法--常用于雙糖管接種3液體接種法--糖類微量生化管4穿刺法-----常用于半固體接種5傾注平板法--自來水細菌計數(shù)6涂布接種法--紙片法藥敏試驗當前23頁，總共52頁。當前24頁，總共52頁。當前25頁，總共52頁。當前26頁，總共52頁。六、生化反應1、各種細菌具有各自獨特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所產(chǎn)生的分解和合成的代謝產(chǎn)物也不同，這些分解或合成代謝產(chǎn)物又各有不同的生化特點，利用此生化特點來檢查代謝產(chǎn)物以鑒別細菌的方法，稱為生化反應。2、生化反應主要分為糖類的代謝試驗、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗、呼吸酶類試驗及其他酶類試驗。當前27頁，總共52頁。2.1碳水化合物的代謝試驗

糖、醇、苷發(fā)酵試驗

糖細菌→生長分解糖產(chǎn)酸PH↓當前28頁，總共52頁。不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。當前29頁，總共52頁。淀粉水解試驗某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。當前30頁，總共52頁。O/F（葡萄糖）試驗細菌分解葡萄糖時利用分子氧—氧化型(O)無氧降解—發(fā)酵型(F)不分解葡萄糖—產(chǎn)堿型(-)一管加石臘油FO堿當前31頁，總共52頁。ONPG試驗

鄰-硝基酚＋β-半乳糖（黃色）β-半乳糖苷酶

細菌＋鄰-硝基-半乳糖

陽性-黃色陰性對照-無色當前32頁，總共52頁。本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。1.下黃上不黃為分解葡萄糖，不分解乳糖2.上下均黃為分解葡萄糖、乳糖3.上下均不黃為非發(fā)酵菌4.中間變?yōu)楹谏珵楫a(chǎn)H2S當前33頁，總共52頁。沙門氏菌的TSI試驗當前34頁，總共52頁。VP、MR試驗

葡萄糖丙酮酸乙酰甲醇→二乙酰＋胍基→紅色VP陽性

肺炎克雷伯菌甲酸、乙酸PH↓＋甲基紅試劑→紅色MR陽性

大腸埃希菌VPMR陽陰陽對當前35頁，總共52頁。V-P試驗某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。當前36頁，總共52頁。甲基紅（MethylRed）試驗腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。當前37頁，總共52頁。2.2蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗

★吲哚試驗

細菌＋（色氨酸酶）蛋白胨水吲哚＋柯氏試劑→紅色當前38頁，總共52頁。靛基質(zhì)（Imdole）試驗某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。當前39頁，總共52頁。★尿素試驗

＋細菌→NH3、PH↑→紅色尿素陽性尿素當前40頁，總共52頁。尿素酶（Urease）試驗有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。1、未接種2、尿素酶陽性3、尿素酶陰性當前41頁，總共52頁?！锉奖彼崦摪泵冈囼?/p>

苯丙氨酸＋細菌→苯丙酮酸＋FeCI3→綠色

當前42頁，總共52頁?！锇被崦擊让冈囼?/p>

石蠟油葡萄糖溴甲酚紫精aa葡萄糖溴甲酚紫賴aa葡萄糖溴甲酚紫烏aa葡萄糖溴甲酚紫對照管當前43頁，總共52頁。2.3碳源和氮源利用試驗

★枸櫞酸鹽試驗

細菌＋檸檬酸三鈉→Na2CO3PH↑→深藍色

當前44頁，總共52頁。枸椽酸鹽試驗某些細菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。當前45頁，總共52頁?！锵跛猁}還原試驗

細菌＋NO3－----------NO2

NO2＋對氨基苯磺酸（甲液）→對重氮基苯磺酸

對重氮基苯磺酸＋α-萘胺（乙液）→紅色（＋）

NO3－＋細菌＋甲、乙液→無色（-）＋鋅粉（還原劑）紅色為陰性無色為陽性NO3－＋細菌→NO2→N2↑＋NH3↑當前46頁，總共52頁。2.4酶類試驗細菌＋血漿結(jié)合凝固酶

纖維蛋白→肉眼可見凝集細菌＋血漿游離凝固酶＋纖維蛋白→血漿凝固

★CAMP試驗

B群鏈球菌產(chǎn)生CAMP因子，促進金葡溶血更好

★凝固酶試驗當前47頁，總共52頁。七、血清學試驗1、基本概念1.1血清學試驗是利用抗原抗體在適宜條件下的體外特異反應，可作為抗原抗體的檢測。1.2抗原：是一種刺激機體引起免疫反應，產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋巴細胞，并能在體外與其相應的抗體（或）致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合反應的物質(zhì)。具有免疫原性和反映原性。1.3抗體：是機體在抗原物質(zhì)刺激下所形成的一類具有與相應抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應的有特定結(jié)構(gòu)的球蛋白。當前48頁，總共52頁。2、基本特性高度特異性:此類反應是由于抗原決定族與抗體結(jié)合部位之間的物理化學特性相對應而相互結(jié)合的，故有特異性。高度敏感性：檢測限可達到納克級甚至皮克級，其中以放免測定的敏感性最高，較差的是凝集反應和各種沉淀反應。合適比例：當抗原抗體的量比例合適時出現(xiàn)明顯的反應