可用于實時熒光定量PCR標準化的白樺內(nèi)參基因-(完整版)實用資料

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收稿2021-05-13修定2021-07-30可用于實時熒光定量PCR標準化的白樺內(nèi)參基因（完整版）實用資料(可以直接使用，可編輯完整版實用資料，歡迎下載）資助黑龍江省自然基金重點項目(ZD202118和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(DL09BA14。*通訊作者(E-mail:yaguangzhan@126;Tel:0451-********?？捎糜趯崟r熒光定量PCR標準化的白樺內(nèi)參基因尹靜1,任春林1,詹亞光1,*,滕文華2,陳秀福1,王玉成3,孫紅冉1東北林業(yè)大學1生命學院;2帽兒山實驗林場,3林學院,哈爾濱150040提要:為了快速、準確的對白樺多個樣品進行基因表達分析,本研究應用熒光定量PCR技術(shù),對白樺持家基因微管蛋白基因(Tu和泛素基因(UbQ在不同處理的細胞及不同樹齡或不同生長季節(jié)白樺植株各部位表達的穩(wěn)定性進行檢測。結(jié)果表明,對于茉莉酸甲酯(MeJA、水楊酸(SA處理的白樺細胞和不同生長季節(jié)白樺植株的基因定量表達分析,可同時使用Tu和UbQ平衡化qRT-PCR數(shù)據(jù);而針對不同樹齡白樺莖皮中基因表達研究時,單獨使用UbQ基因作為內(nèi)參對照即可獲得精確的表達數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞:白樺;實時定量PCR;持家基因SelectionofInternalControlGenesforReal-TimeRT-PCRNormalizationinWhiteBirch(BetulaplatyphyllaSuk.YINJing1,RENChun-Lin1,ZHANYa-Guang1,*,TENGWen-Hua2,CHENXiu-Fu1,WANGYu-Cheng3,SUNHong-Ran11CollegeofLifeSciences,2MaoershanExperimentalForestryCenter,3CollegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,ChinaAbstract:Inordertofacilitaterapidandaccurategeneexpressionanalysisofmultiplesamplesfrombirch,theexpressionstabilityofhousekeepinggenessuchasgenescodingmicro-tubeprotein(Tuandubiquitin(UbQwereassessedbyqRT-PCRusingasetofcDNAsfromdifferentbirchsamplesincludingcellsafterdifferenttreatmentsanddifferentpartsofbirchplantsindifferentagesordifferentgrowingseasons.Theresultssug-gestedthattheTuandUbQgenescouldprovidedsuperiortranscriptnormalizationinbirchcellstreatedwithdifferentelicitors(MeJAandSA,andbirchplantsindifferentgrowingseasons,whileUbQgenewastherecommendedreferencegeneforgeneexpressionstudiesusingcDNAsfromwhitebirchbarkindefferentyears.Keywords:birch;real-timeRT-PCR;housekeepinggene實時定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR因為快速、靈敏和定量的特點,已經(jīng)成為分析基因轉(zhuǎn)錄水平及進行芯片和微點陣數(shù)據(jù)驗證的常用手段,這種方法比傳統(tǒng)的Northern雜交更安全和精確,并且所需起始材料的量較少。但是實驗過程會因為RNA的質(zhì)量和數(shù)量、cDNA合成效率以及PCR擴增的差異而導致結(jié)果嚴重偏差(Vandesompele等2002。為了得到更精確的數(shù)據(jù),通常需要一個和多個內(nèi)對照基因來平衡化qRT-PCR數(shù)據(jù)。目前一般選擇持家基因(housekeepinggene作為內(nèi)對照,持家基因編碼的蛋白是維持細胞結(jié)構(gòu)和基本代謝所必需,所以其表達水平在各種環(huán)境下基本保持一致。持家基因包括泛素(ubiquitin,UbQ、肌動蛋白(actin、微管蛋白(tubulin,Tu、組蛋白(histone、18SrRNA以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH等基因。然而,很多持家基因的表達水平隨著環(huán)境的改變和組織部位的不同而發(fā)生變化(Thellin等1999;Lee等2002;Czechowski等2005,如肌動蛋白基因是葡萄漿果發(fā)育過程中最穩(wěn)定的內(nèi)對照基因之一(Reid等2006,但在某些實驗中肌動蛋白則表現(xiàn)不穩(wěn)定(涂禮莉等2007。Nicot等(2005研究表明,在馬鈴薯應對生物脅迫(晚疫病和非生物脅迫(冷和鹽害過程中,內(nèi)參基因選擇因處理不同而差異顯著。因此,選擇合適的持家基因作為qRT-PCR內(nèi)參非常必要。白樺的樹葉和樹皮中富含三萜類化合物,藥用價值廣泛,加之其生長迅速,材質(zhì)優(yōu)良,是重要的經(jīng)濟樹種。本實驗以白樺細胞和白樺植株為試材,對持家基因UbQ和Tu在白樺細胞懸浮培養(yǎng)過程及白樺植株不同組織表達水平的穩(wěn)定性進行了檢測,以期為白樺中重要基因的定量表達研究提供更為準確的數(shù)據(jù)。材料與方法1實驗材料1.1白樺細胞來源及處理白樺(BetulaplatyphyllaSuk.母樹取自本校白樺強化種子園,5~7年生嫁接優(yōu)樹(接穗30年生誘導的組培苗。以白樺組培苗莖段為外植體,NT為基本培養(yǎng)基,附加激素0.01mg·L-1TDZ和0.1mg·L-1BA,誘導愈傷組織。穩(wěn)定繼代3次后,取3g(FW愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有100mL相同液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶。懸浮培養(yǎng)第7天進行水楊酸(SA誘導處理,同時設(shè)立對照組(等量的0.5%乙醇水溶液。SA的終濃度為50mg·L-1,處理后0h、2h、12h、1d、3d、5d和7d分別收獲細胞。處理重復3次,每次均按如上取樣。細胞于液氮速凍,-80℃保存,待提取RNA。以白樺無菌苗莖段為外植體,IS為基本培養(yǎng)基,附加激素0.8mg·L-16-BA和0.6mg·L-1NAA誘導愈傷組織,穩(wěn)定繼代3次后,取3g(FW愈傷組織轉(zhuǎn)移到250mL三角瓶中進行懸浮培養(yǎng),其中含有100mLB5液體培養(yǎng)基,添加激素0.2mg·L-16-BA和0.6mg·L-1TDZ,然后在懸浮培養(yǎng)的第7天分別進行10μmol·L-1和100μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA及500μmol·L-1布洛芬(IBU,即MeJA合成專一性抑制劑3種處理,同時設(shè)立對照組(0.5%乙醇水溶液,每種處理重復3次。MeJA和IBU處理后0h、6h、12h、1d、2d和3d分別收獲細胞。細胞于液氮速凍,-80℃保存,待提取RNA。NT和B5液體培養(yǎng)基均添加20g·L-1蔗糖、pH值為6.0~6.5,以121℃高壓蒸汽滅菌20min,培養(yǎng)溫度為23℃~26℃,光照強度為40μmol·m-2·s-1,光照時間為16h·d-1,濕度為65%左右,搖床轉(zhuǎn)速為120r·min-1。1.2白樺植株來源及取樣不同樹齡(一年生、四年生、六年生、八年生白樺植株來自東北林業(yè)大學白樺強化種子園,除一年生白樺苗在2021年5月~10月期間每月取樣外,其余樹齡均于6月中旬一次取樣。樣品包括不同樹齡葉片、根皮和莖皮部分。液氮速凍后,-80℃冰箱保存,待提取RNA。2實驗方法2.1RNA抽提及cDNA合成RNA提取采用Tris-CTAB法,不同樣品總RNA用DNaseI(Promega處理,RNA完整性通過1.4%(W/V瓊脂糖膠電泳檢測。用EppendorfDU800分光光度計(EppendorfAG分析核酸濃度。取A260/A280在1.9~2.1之間及A260/A230大于2.0的RNA進行cDNA合成。cDNA的合成操作參照TaKaRaPrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit說明書,以500ng總RNA為起始材料,合成cDNA第一鏈。反應結(jié)束后,加180μL去離子水稀釋,于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2實時熒光定量PCR反應體系及程序選擇白樺微管蛋白基因(alpha-tubulin,Tu,GenBank號為FG067376和泛素基因(Ubiquitin,UbQ,GenBank號為FG0656182個持家基因,根據(jù)已知基因序列,同時依據(jù)real-timeRT-PCR引物設(shè)計原則,利用PrimerPremier5.0軟件進行引物設(shè)計。引物序列見表1。表1實時熒光定量PCR使用的持家基因引物序列Table1Primersforquantitativereal-timePCR基因5'→3'UbQ(RGATTGAGGGGAGGGATGCTGUbQ(LGGAGGACAAGGTGGAGGGTGTu(RTCAACCGCCTTGTCTCTCAGGTu(LTGGCTCGAATGCACTGTTGG實時熒光定量PCR所用試劑盒為TOYOBO公司(日本生產(chǎn)的SYBRGreenRealtimePCRMasterMix-Plus-(codeNo.QPK-212T。PCR反應體系含有3.1μL蒸餾水、10μLSYBRGreenRealtimePCRMasterMix-Plus-,2μLPlussolution、1.2μL引物R(10μmol·L-1、1.2μL引物L(10μmol·L-1、2.5μL稀釋的cDNA模板。所有試驗樣品均重復3次。PCR反應在OPTIONII(MJResearch公司熒光定量PCR儀上完成。PCR反應程序為:94℃預變性30s;94℃變性12s;58℃退火30s;72℃延伸40s;82℃,1s;讀板。45次循環(huán)。每0.5℃進行熔解曲線(meltingcurve掃描,溫度范圍55~99℃。結(jié)果與討論1SA處理下白樺細胞中持家基因表達變化設(shè)定0.01為熒光定量PCR的閾值,Tu和UbQ這2個持家基因的熔解曲線均為單一峰值,熔解溫度分別為84℃和86℃,確定產(chǎn)物單一。結(jié)合PCR測序結(jié)果,與已知白樺基因Tu和UbQ序列同源性達99%,1個堿基的差異可能是熒光產(chǎn)物測序過程中造成的誤差。圖1水楊酸(50mg·L-1處理的白樺細胞中持家基因Tu和UbQ的Ct檢測值Fig.1TheCtvalueofhousekeepinggenesTuandUbQinbirchcellstreatedwith50mg·L-1salicylicacid表2不同處理下白樺細胞及白樺植株各部位中持家基因Ct值變異系數(shù)Table2ThecoefficientofvariationofCtvalueofhousekeepinggeneindifferentcellsunderdifferenttreatmentsandindifferentpartsofbirchtrees材料持家基因最大值最小值平均值標準差(SD變異系數(shù)(CVMeJA處理白樺細胞25.20320.12522.4772.1170.094圖2茉莉酸甲酯及其抑制劑IBU處理的白樺細胞中持家基因Tu和UbQ的Ct值檢測Fig.2TheCtvalueofhousekeepinggenesTuandUbQofbirchcellstreatedwithMeJAandIBU0h:處理前;6hIBU:500μmol·L-1IBU處理6h;12hIBU:500μmol·L-1IBU處理12h;1dIBU:500μmol·L-1IBU處理1d;2dIBU:500μmol·L-1IBU處理2d;3dIBU:500μmol·L-1IBU處理3d;6hMeJA/10:10μmol·L-1MeJA處理6h;12hMeJA/10:10μmol·L-1MeJA處理12h;1dMeJA/10:10μmol·L-1MeJA處理1d;2dMeJA/10:10μmol·L-1MeJA處理2d;3dMeJA/10:10μmol·L-1MeJA處理3d;6hMeJA/100:100μmol·L-1MeJA處理6h;12hMeJA/100:100μmol·L-1MeJA處理12h;1dMeJA/100:100μmol·L-1MeJA處理1d;2dMeJA/100:100μmol·L-1MeJA處理2d;3dMeJA/100:100μmol·L-1MeJA處理3d。2MeJA處理的白樺細胞中持家基因表達變化由圖2表明,經(jīng)過IS培養(yǎng)基誘導愈傷組織,再在B5培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)的白樺細胞,在培養(yǎng)中期(第7天加入不同濃度(10μmol·L-1和100μmol·L-1MeJA或MeJA合成的專一性抑制劑IBU(500μmol·L-1后不同時間取樣,結(jié)果表明,Tu基因在10μmol·L-1和100μmol·L-1MeJA分別處理12h及IBU處理1d時,Ct值極顯著高于其他處理;UbQ基因在各處理間表圖3一年生白樺植株不同部位持家基因Tu和UbQ的Ct值變化Fig.3TheCtvalueofhousekeepinggenesTuandUbQindifferenttissuesofwhitebirch達變化很小,且以Tu+UbQ同時使用時變異系數(shù)最低,可以明確同時使用這2個持家基因組合作為MeJA及其抑制劑IBU處理的白樺細胞基因定量表達的內(nèi)參對照效果最佳。3白樺植株中持家基因表達變化在整個生長季節(jié)(哈爾濱6~10月期間,一年生白樺植株中根皮、葉片和莖皮中持家基因Tu和UbQ的表達略有變化,如Tu基因在6月、7月莖皮及8月根中表達量較高(Ct值低于其他處理外,其他處理間相對穩(wěn)定;UbQ基因在6月葉、根,7月和10月葉中,Ct值較高;而Tu+UbQ基因Ct值在6對不同樹齡白樺莖皮中持家基因Tu和UbQ的Ct值檢測結(jié)果表明,一年生、四年生、六年生和八年生的白樺莖皮中Tu基因及Tu+UbQ基因Ct值乳制品生產(chǎn)企業(yè)安全生產(chǎn)標準化評定標準考評說明1.本評定標準適用于乳制品生產(chǎn)企業(yè)。2.本評定標準共13項考評類目、47項考評項目和153條考評內(nèi)容。3.在本評定標準的“自評/評審描述”列中,企業(yè)及評審單位應根據(jù)“考評內(nèi)容”和“考評辦法”的有關(guān)要求,針對企業(yè)實際情況,如實進行扣分點說明、描述,并在《自評扣分點及原因說明匯總表》(見附表中逐條列出。4.本評定標準中累計扣分的,直到該考評內(nèi)容分數(shù)扣完為止,不得出現(xiàn)負分。有需要追加扣分的,在該考評類目內(nèi)進行扣分,也不得出現(xiàn)負分。5.本評定標準共計1000分。最終評審評分換算成百分制,換算公式如下:最后得分采用四舍五入,取小數(shù)點后一位數(shù)。6.標準化等級分為一級、二級和三級,一級為最高。評定所對應的等級須同時滿足評審評分和安全績效等要求,取最低的等級來確定標準化等級(見下表?！?—乳制品生產(chǎn)企業(yè)安全生產(chǎn)標準化評定標準自評/評審單位:自評/評審時間:從年月日到年月日自評/評審組組長:自評/評審組主要成員:—2——3——4——5—冶金企業(yè)安全生產(chǎn)標準化評定標準(煉鋼考評說明1.本評定標準所指的煉鋼企業(yè)包括鋼鐵聯(lián)合企業(yè)中的煉鋼單元及獨立煉鋼生產(chǎn)企業(yè),適用于煉鋼企業(yè)開展安全生產(chǎn)標準化自評、申請、外部評審及各級安全監(jiān)管部門監(jiān)督審核等相關(guān)工作。2.在考核年度內(nèi)未發(fā)生較大及以上生產(chǎn)安全事故、依法生產(chǎn)的煉鋼企業(yè),可以參加安全生產(chǎn)標準化等級考評。3.本評定標準分為13項考評類目、47項考評項目和211條考評內(nèi)容。4.在評定標準表中的自評/評審描述列中,企業(yè)及評審單位應根據(jù)評定標準的有關(guān)要求,針對企業(yè)實際情況,如實進行得分及扣分點說明、描述,并在自評扣分點及原因說明匯總表(見附表中逐條列出。5.本評定標準中累計扣分的,均為直到該考評內(nèi)容分數(shù)扣完為止,不出現(xiàn)負分。有特別說明扣分的(在考評辦法中加粗的內(nèi)容,應在該類目內(nèi)進行扣分。6.本評定標準共計650分,最終標準化得分換算成百分制。換算公式如下:標準化得分(百分制=標準化工作評定得分÷(650-不參與考評內(nèi)容分數(shù)之和×100。最后得分采用四舍五入,取小數(shù)點后一位數(shù)。7.標準化等級共分為一級、二級、三級,其中一級為最高。評定所對應的等級應同時滿足標準化得分和安全績效要求,取其中較低的等級確定最后標準化等級(見下表。8.煉鋼企業(yè)安全生產(chǎn)標準化考評程序、有效期、等級證書和牌匾等按照《全國冶金等工貿(mào)企業(yè)安全生產(chǎn)標準化考評辦法》(安監(jiān)總管四〔2021〕84號中的有關(guān)要求執(zhí)行。2021年1月31日國家安全監(jiān)管總局印發(fā)的《冶金企業(yè)安全標準化煉鋼單元考評標準》(安監(jiān)總管一〔2021〕23號同時廢止。冶金企業(yè)安全生產(chǎn)標準化評定標準(煉鋼自評/評審單位:自評/評審時間:從年月日到年月日自評/評審組組長:自評/評審組主要成員:—37——38——39—考評類目考評標準考評內(nèi)容項目分值13.1績效應建立安全標準化績效評定的管評定理制度，明確組織、時間、人員、內(nèi)容2范圍、方法與技術(shù)、過程、報告與分析等要求。通過評估與分析，發(fā)現(xiàn)安全管理過程中的責任履行、系統(tǒng)運行、檢查監(jiān)控、隱患整改、考評考核等方面存在的問2題，由安全生產(chǎn)委員會或安全領(lǐng)導機構(gòu)討論提出糾正、預防的管理方案，并納入下一周期的安全工作實施計劃中。應每年至少一次對安全生產(chǎn)標準化實施情況進行評定，并形成正式的評定報告。發(fā)生死亡事故后，應重新進行評定。2評分標準無該項制度的，不得分；制度中每缺少一項要求的，扣1分；制度缺乏操作性和針對性的，扣1分。未進行討論且未形成會議紀要的，不得分；糾正、預防的管理方案，未納入下一周期實施計劃的，扣1