蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)進(jìn)展

主要內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景1、雙向凝膠電泳技術(shù)2、雙向差異凝膠電泳技術(shù)3、同位素親和標(biāo)簽技術(shù)4、同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)（重點(diǎn)）當(dāng)前1頁，總共44頁。蛋白質(zhì)組學(xué)背景隨著人類基因組計(jì)劃的完成和對基因組研究的深入，人們認(rèn)識到單純依靠基因組信息并不可能完全揭示生命的奧秘。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)才是生物功能的體現(xiàn)者，所以必需考慮基因編碼的蛋白質(zhì)具有什么功能。當(dāng)前2頁，總共44頁。不僅如此，基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控,蛋白質(zhì)往往還要經(jīng)過剪接、修飾、加工之后，最終才能成為有功能的蛋白質(zhì)；而且生物體不同組織、不同分化程度和在不同環(huán)境下，所表達(dá)的蛋白質(zhì)是不同的，所以單純從基因組水平上并不能完全揭示生命活動(dòng)的規(guī)律。在這種背景下，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。1994年，MarcWilkim在Siena雙向凝膠電泳(two—dimen．sionalelectrophoresis，2-DE)會(huì)議上最早提出了蛋白質(zhì)組(proteome)概念，并于1995年7月的Electrophoresis(電泳)雜志上發(fā)表。當(dāng)前3頁，總共44頁。蛋白質(zhì)組學(xué)是以生物體的全部或部分蛋白為研究對象，研究它們在生命活動(dòng)過程中的作用、功能。蛋白質(zhì)組學(xué)較之前的基因組學(xué)對于生命現(xiàn)象的解釋更直接、更準(zhǔn)確。蛋白質(zhì)對生命活動(dòng)的直接作用比基因復(fù)雜得多．對于某一種生物或有機(jī)體來說，基因組是唯一的，而蛋白質(zhì)組隨細(xì)胞的種類、功能、生理狀態(tài)、環(huán)境條件和病理狀態(tài)而不斷變化，因此僅僅從基因的角度來研究是不夠的。當(dāng)前4頁，總共44頁。

隨著對蛋白質(zhì)組學(xué)的深入理解和具體工作的開展，人們逐漸認(rèn)識到在短時(shí)間內(nèi)建立蛋白質(zhì)組學(xué)“完整的”數(shù)據(jù)庫和實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)資源共享是難以實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)闂l件尚未成熟。于是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究著重于尋找和篩選任何有意義的因素引起的2個(gè)樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，揭示細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的進(jìn)程與本質(zhì)、對外界環(huán)境刺激的反應(yīng)途徑，以及細(xì)胞調(diào)控機(jī)制，同時(shí)獲得對某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能分析，因此，差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。當(dāng)前5頁，總共44頁。1、雙向凝膠電泳技術(shù)1975年,意大利生化學(xué)家O’Farrell（奧法雷爾）發(fā)明了雙向電泳(two—dimensionalgeleldctropgoresis，2-DE)技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用兩個(gè)不同分離原理為依據(jù)進(jìn)行分離，即利用蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)(PI)和相對分子量的不同進(jìn)行分離．第一向電泳是蛋白質(zhì)的等電聚焦，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)差異進(jìn)行分離，該分離技術(shù)采用固定pH梯度技術(shù)(IPG)可以實(shí)現(xiàn)等電點(diǎn)只差0．01pH單位的蛋白質(zhì)的分離；第二向電泳是利用蛋白質(zhì)相對分子量差異進(jìn)行分離，可分離相對分子量在100×103～150×103的蛋白質(zhì)。當(dāng)前6頁，總共44頁。當(dāng)前7頁，總共44頁。例如：番茄種子空間搭載與地面后代葉片的差異蛋白質(zhì)組研究。CK-2是對照組，MIR-2是實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)前8頁，總共44頁。圖1用不同裂解液裂解后的CK-2雙向電泳圖左圖裂解液中的去垢劑用的是CHAPS,右圖裂解液中的去垢劑是NP-40。當(dāng)前9頁，總共44頁。圖2

對照樣品CK以及和平號搭載樣品MIR的雙向電泳結(jié)果圖當(dāng)前10頁，總共44頁。樣品MIR-2和對照組CK-2的雙向電泳結(jié)果進(jìn)行了IMAGEMASTER軟件分析,共找到了42個(gè)表達(dá)差異2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn),對其中26個(gè)差異比較明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了ESIQ-TOFMS/MS質(zhì)譜分析,共鑒定出10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),鑒定的蛋白質(zhì)在對照組均表現(xiàn)為上調(diào),在空間站搭載樣品中表現(xiàn)為下調(diào)。當(dāng)前11頁，總共44頁。2-DE的局限性:重復(fù)性差;自動(dòng)化程度低,費(fèi)時(shí)費(fèi)力;對過大(>100ku)和過小(<10ku)的分子量的蛋白質(zhì)、低豐度蛋白質(zhì)(<1000copies)、極酸或極堿和難溶的蛋白質(zhì)如膜蛋白等分離困難。當(dāng)前12頁，總共44頁。2、雙向差異凝膠電泳技術(shù)

雙向差異凝膠電泳(twodimensiondifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)是一種新出現(xiàn)的熒光標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比經(jīng)典的2-DE具有更高的動(dòng)力學(xué)范圍和靈敏性。該方法通過引入內(nèi)標(biāo)使得多個(gè)樣品在一塊膠上分離，進(jìn)而減少了實(shí)驗(yàn)條件不一致引起的誤差。DIGE技術(shù)可檢測到表達(dá)差異小于10％的蛋白，統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95％以上。當(dāng)前13頁，總共44頁。DIGE系統(tǒng)基于熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)技術(shù)，是利用電荷和分子量的差異分離蛋白質(zhì)混合物，并通過多通道激光掃描分析不同蛋白質(zhì)的第二向SDS凝膠圖像。DIGE系統(tǒng)結(jié)合了新型熒光技術(shù)、樣品多路技術(shù)(samplemultiplexing)和圖像分析等特有的技術(shù)，是一套優(yōu)于經(jīng)典的2-DE的完整的系統(tǒng)。當(dāng)前14頁，總共44頁。DIGE的試驗(yàn)流程AmershamPharmaciaBiotech,LifeScienceNews,7,2001

當(dāng)前15頁，總共44頁。例如：曹曉艷等利用雙向差異凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜檢測技術(shù)在“新世紀(jì)”杏的小蕾期、大蕾期、自花授粉后24h、異花授粉24h后的花柱中共檢測到1500個(gè)蛋白點(diǎn)，其中66個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，證明“新世紀(jì)”杏花花柱對自體與異體花粉感應(yīng)在蛋白質(zhì)組水平上有差異。當(dāng)前16頁，總共44頁。a小蕾期b大蕾期c自花授粉后24hd異花授粉后24h當(dāng)前17頁，總共44頁。DIGE技術(shù)與傳統(tǒng)的2-DE方法相比,優(yōu)點(diǎn)在于:重復(fù)性大大提高、蛋白質(zhì)樣品的差異表達(dá)更精確直觀、動(dòng)態(tài)范圍更寬、染色時(shí)間短、熒光標(biāo)記不會(huì)影響質(zhì)譜分析結(jié)果。缺點(diǎn)是其標(biāo)記方法只適用于含有賴氨酸的蛋白質(zhì);對于賴氨酸含量少的蛋白質(zhì)的DIGE標(biāo)記有一定的困難。因?yàn)橹挥幸恍〔糠值鞍踪|(zhì)被標(biāo)記,大部分蛋白質(zhì)在Cy3、Cy5標(biāo)記的譜圖上看不到。當(dāng)前18頁，總共44頁。3、同位素親和標(biāo)簽技術(shù)同位素親和標(biāo)記(isotope-codedaffinitytags,ICAT)技術(shù)最早由Gygi等提出。ICAT技術(shù)是利用一種新的化學(xué)試劑-同位素親和標(biāo)簽試劑預(yù)先選擇性地標(biāo)記某一類蛋白質(zhì),分離純化后,質(zhì)譜(massspectrometry,MS)鑒定。并根據(jù)質(zhì)譜圖上不同ICAT試劑標(biāo)記的一對肽段離子的強(qiáng)度比例,定量分析它的母體蛋白質(zhì)在原來細(xì)胞中的相對豐度。當(dāng)前19頁，總共44頁。ICAT試劑由三部分組成。①試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)的基團(tuán),這個(gè)基團(tuán)特異結(jié)合肽鏈中半胱氨酸殘基的巰基;②中間的連接子,可以結(jié)合穩(wěn)定的同位素;③親和標(biāo)簽-生物素(Biotin),可以和卵白素結(jié)合,選擇分離ICAT標(biāo)記的多肽。試劑分為兩種形式,分別稱之為“重”(連接子含有8個(gè)氘原子)和“輕”(連接子含有8個(gè)氫原子);由8個(gè)氘原子與8個(gè)氫原子分別標(biāo)記的ICAT質(zhì)量正好相差8Da。當(dāng)前20頁，總共44頁。

ICAT技術(shù)的具體操作流程是:①兩種來源密切相關(guān)而不同狀態(tài)的細(xì)胞裂解,蛋白質(zhì)被還原;②兩種樣品中各加入不同的ICAT試劑標(biāo)記;③標(biāo)記完全后的兩種樣品混合,胰酶水解成大小不同的肽段;④固相陽離子柱交換,除去所有殘留的胰酶、去垢劑、還原劑和ICAT試劑;當(dāng)前21頁，總共44頁。⑤標(biāo)記與未標(biāo)記的肽段經(jīng)卵白素親和層析分離;⑥標(biāo)記的肽段洗脫后經(jīng)液相色譜(liquidchromatography,LC)再次分離,串聯(lián)質(zhì)譜(tandemmassspectrometry,MS/MS)分析,通過比較峰型完全一樣的一對肽段峰的離子強(qiáng)度,可以推斷出兩種樣品中同一種蛋白的相對含量,再將質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)提交數(shù)據(jù)庫檢索,鑒定相對應(yīng)的蛋白質(zhì)。當(dāng)前22頁，總共44頁。Han等通過乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)誘導(dǎo)人類骨髓白血病細(xì)胞(HL-60)的細(xì)胞表面蛋白的分化,使用ICAT試劑標(biāo)記分化的蛋白,鑒定了未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞的491種蛋白的豐度比。Hardwidge等通過ICAT結(jié)合電噴霧離子化串聯(lián)MS方法首次大規(guī)模地分析人類細(xì)胞對病原體腸致病性大腸桿菌(EPEC)的反應(yīng),他們在Caco-2單細(xì)胞層中分離并鑒定了超過2000種單一蛋白,其中13%與EPEC引起的腹瀉相關(guān)。當(dāng)前23頁，總共44頁。與雙向電泳技術(shù)相比,ICAT技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn):①因?yàn)榉蛛x在肽段水平上進(jìn)行,可以對膜蛋白進(jìn)行鑒定和定量;②通過選擇標(biāo)記含半胱氨酸肽段,降低了蛋白質(zhì)混合物的復(fù)雜性③比較兩種或更多種來源密切相關(guān)的蛋白質(zhì)樣品,可以得到不同狀態(tài)下蛋白表達(dá)量的變化比例。④對于含有多個(gè)半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì),通過重復(fù)檢索含多半胱氨酸的肽段可得到肯定的鑒定和定量;⑤因?yàn)镮CAT技術(shù)建立在色譜分離的基礎(chǔ)上,任何促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的試劑均可使用;⑥能夠直接鑒定和測量低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前24頁，總共44頁。其最大的缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)序列中必須含有半胱氨酸，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)將會(huì)被遺失。當(dāng)前25頁，總共44頁。4、同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)開發(fā)的同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術(shù)是一種新的、功能強(qiáng)大的可同時(shí)對四種或八種樣品進(jìn)行相對或絕對定量研究的方法。當(dāng)前26頁，總共44頁。iTRAQ試劑由三個(gè)部分組成：第一部分為肽段反應(yīng)基團(tuán)，由于它活躍的化學(xué)性質(zhì)，在弱堿性條件下可以迅速和伯胺基團(tuán)反應(yīng)，也就是和肽段的氨基端以及賴氨酸的ε氨基發(fā)生共價(jià)化學(xué)反應(yīng)，從而使得每個(gè)肽段都帶上標(biāo)記。第二部分為報(bào)告基團(tuán)，它是由一系列C、N、O的穩(wěn)定同位素組合而成的分子量相隔1Da的小分子，在iTRAQ4-plex中，包含114、115、116、117Da四種報(bào)告基團(tuán)；在iTRAQ8-plex中，包括從113至121Da八種不同分子量的報(bào)告基團(tuán)，由于苯丙氨酸的immoniumion分子量為120Da，所以分子量為120Da的報(bào)告離子沒有被采用。當(dāng)前27頁，總共44頁。ReportergroupMass:114to117PeptideReactiveGroupIsobaricTag:TotalMass=145BalancegroupMass:31to28PRG當(dāng)前28頁，總共44頁。第三部分為平衡中性基團(tuán)，平衡基團(tuán)主要消除報(bào)告基團(tuán)所引入的質(zhì)量差異，因此不同標(biāo)記試劑的平衡基團(tuán)分子量也相對應(yīng)發(fā)生變化，使得平衡基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)的質(zhì)量之和最終為一個(gè)定值，這樣在質(zhì)譜檢測的一級譜圖上就觀察不到質(zhì)量偏差.當(dāng)前29頁，總共44頁。由于iTRAQ試劑是由一系列C、N、O的穩(wěn)定同位素組合而成，其基本分子結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，不同標(biāo)記試劑標(biāo)記的相同肽段在物理化學(xué)特性上沒有差異，因而其色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜離子化效率也基本一致，從而保證經(jīng)不同標(biāo)記試劑標(biāo)記后的相同肽段能同時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜分析。iTRAQ試劑標(biāo)記好的多肽在進(jìn)行一級質(zhì)譜分析時(shí)不發(fā)生斷裂，在二級質(zhì)譜檢測前進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，此時(shí)iTRAQ試劑的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生的報(bào)告基團(tuán)用于后續(xù)的定量分析，平衡基團(tuán)由于中性丟失無法被檢測，反應(yīng)基團(tuán)則仍偶聯(lián)在肽段的N端。當(dāng)前30頁，總共44頁。等量不同來源的蛋白樣品（一般每個(gè)樣品100ug）經(jīng)過還原烷基化、胰酶消化成肽段后，分別用帶有不同大小報(bào)告基團(tuán)的iTRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記。待標(biāo)記反應(yīng)完全之后，將不同報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的肽段等量混合，利用多維液相色譜對混合肽段進(jìn)行分離，最終進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量分析。由于標(biāo)記的肽段的理化性質(zhì)基本一致，因此不同樣品來源的同一肽段將被同時(shí)洗脫和離子化。實(shí)驗(yàn)流程當(dāng)前31頁，總共44頁。在進(jìn)行一級質(zhì)譜檢測時(shí)，不同報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的同一肽段的分子量一致，在譜圖中疊加成一個(gè)峰，從而便于質(zhì)譜儀進(jìn)行母離子選擇。在進(jìn)入二級質(zhì)譜檢測時(shí)，母離子碎裂成一系列的碎片離子及報(bào)告離子，碎片離子則可以用于肽段的序列鑒定，產(chǎn)生的報(bào)告離子則可用于蛋白的定量分析，通過比較不同分子量大小的報(bào)告離子質(zhì)譜峰強(qiáng)度來對不同樣品來源的肽段進(jìn)行定量比較。當(dāng)前32頁，總共44頁。當(dāng)前33頁，總共44頁。當(dāng)前34頁，總共44頁。當(dāng)前35頁，總共44頁。當(dāng)前36頁，總共44頁。蘋果酸脫氫酶當(dāng)前37頁，總共44頁。四分體：C1S1單核期：C2S2二核期：C3S3

7.21華大差異蛋白結(jié)果.xls可育不育當(dāng)前38頁，總共44頁。在本實(shí)驗(yàn)室做的關(guān)于BNS不育系與轉(zhuǎn)換系的花藥差異蛋白的研究中，用2-DE做出來的結(jié)果是：在單核靠邊期-二核期，分離出來的差異蛋白為14個(gè)；而用iTRAQ做出來的結(jié)果為：單核期的差異蛋白為85個(gè)，二核期的差異蛋白為84個(gè)。而且，iTRAQ可以比較四分體-二核生長過程中的蛋白質(zhì)的變化。2-DE與iTRAQ結(jié)果的比較當(dāng)前39頁，總共44頁。1、通量高，能夠同時(shí)對多達(dá)8組的樣品進(jìn)行定量比較，大大降低了實(shí)驗(yàn)過程中所引入的技術(shù)誤差。2、覆蓋率高，iTRAQ試劑與肽段的氨基端或多肽賴氨酸殘基上的氨基基團(tuán)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，幾乎所有的肽段都能被標(biāo)記用于定量分析，使得定量的結(jié)果更為準(zhǔn)確。3、標(biāo)記效率高，體外進(jìn)行，反應(yīng)迅速，98%肽段在30分鐘內(nèi)都能被標(biāo)記。優(yōu)點(diǎn)當(dāng)前40頁，總共44頁。4、定量技術(shù)準(zhǔn)確度高，iTRAQ是基于質(zhì)譜二級譜圖進(jìn)行蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，產(chǎn)生的報(bào)告離子位于質(zhì)譜的低分子量區(qū)域，低分子量區(qū)域是質(zhì)譜定性和定量較