蛋白質(zhì)分分離純化和表征3

等電點(diǎn)（pI）:在特定pH條件下，某種蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷相等，靜電荷為零，這一pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。幾種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)當(dāng)前1頁，總共36頁。等電pH并不是一個恒定的值，它會因溶液中鹽的種類和離子強(qiáng)度的影響而有所不同。

等離子點(diǎn)(isoionicpiont):

蛋白質(zhì)在純水溶液中的帶電狀態(tài)則沒有其他離子干擾，完全由H+的解離和結(jié)合來決定，這種條件下的等電點(diǎn)稱為等離子點(diǎn)。等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)。當(dāng)前2頁，總共36頁。二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測定蛋白質(zhì)的分子量的范圍：6×103～1×106Da。當(dāng)前3頁，總共36頁。（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子量用化學(xué)分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量。并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中含有一個被測元素的原子，則可由此計算出蛋白質(zhì)的最低分子量。

例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計算二者的相對分子質(zhì)量。

最低相對分子量＝x100=鐵的百分含量鐵的原子量0.33555.8x100=16700測定蛋白質(zhì)相對分子量的原理和方法也可以利用蛋白質(zhì)中含量特少的aa，用同樣的原理計算蛋白質(zhì)的最低分子量。當(dāng)前4頁，總共36頁。（二）滲透壓法測定相對分子量滲透壓法測定Mr操作簡單，Mr在10-100kDa時較準(zhǔn)，但不能區(qū)別蛋白質(zhì)分子是否均一。滲透壓公式：Mr

=RTlimc→0πc(c=質(zhì)量濃度，g/mol)當(dāng)前5頁，總共36頁。（三）沉降分析測定Mr在強(qiáng)大的離心場中，如果蛋白質(zhì)溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白質(zhì)會發(fā)生沉降。沉降速度決定于蛋白質(zhì)的分子量、分子密度、分子形狀和溶劑的密度、粘度。

沉降系數(shù)（Ｓ20,w）：單位離心場強(qiáng)度時的沉降速度。定義1Ｓ＝10-13秒（斯維得貝格單位）沉降速度法沉降平衡法當(dāng)前6頁，總共36頁。（四）凝膠過濾法測定Mr凝膠過濾（層析）可按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，同時可以測定蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve（Ve為洗脫體積），并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測當(dāng)前7頁，總共36頁。（五）SDS法測定Mr聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。

當(dāng)前8頁，總共36頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis當(dāng)前9頁，總共36頁。1．蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)顆粒大小屬于膠體粒子的范圍(1-100nm)。又由于其分子表面有許多極性基團(tuán)，親水性極強(qiáng)，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。蛋白質(zhì)親水膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個因素：雙電層水化層a.丁達(dá)爾效應(yīng)

b.布朗運(yùn)動

c.不能透過半透膜三、膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀當(dāng)前10頁，總共36頁。2．蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結(jié)沉淀現(xiàn)象，這既是所謂的蛋白質(zhì)沉淀作用。①鹽析法（saltingout）：中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→蛋白質(zhì)脫去水化層。

優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白質(zhì)變性。鹽溶（saltingin）：稀鹽溶液中蛋白質(zhì)溶解度增加的現(xiàn)象。當(dāng)前11頁，總共36頁。②有機(jī)溶劑沉淀法：極性有機(jī)溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）→脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用。

條件：低溫操作，縮短時間。

③重金屬鹽沉淀法：

當(dāng)溶液pH>pI,蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷,易與重金屬離子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)→生成沉淀。

④生物堿試劑和某些酸類沉淀法：

生物堿試劑—能引起生物堿沉淀的一類試劑。當(dāng)溶液pH<pI時,蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷→易與生物堿試劑,酸根負(fù)離子反應(yīng)→沉淀

用途：臨床除去體液中干擾測定的蛋白質(zhì)當(dāng)前12頁，總共36頁。⑤加熱變性測定法原因：加熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，損壞了水化層

用途：制豆腐（加熱+少量鹽鹵）當(dāng)前13頁，總共36頁。1.定義：在某些物理或化學(xué)因素作用下，天然蛋白質(zhì)嚴(yán)密的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失（如酶失去催化活力，激素喪失活性），則稱之為蛋白質(zhì)變性作用(denaturation)

。

有些蛋白質(zhì)的變性是可逆的，通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缤肝觯⒆冃詣┏ズ?，蛋白質(zhì)可以恢復(fù)其天然立體結(jié)構(gòu)，這個過程稱為復(fù)性（renaturation）。

一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級鍵的破壞，只有空間構(gòu)象的改變，并不涉及一級結(jié)構(gòu)（共價鍵）的變化。四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性當(dāng)前14頁，總共36頁。當(dāng)前15頁，總共36頁。

化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑、尿素等

物理因素：加熱、射線、超聲波、劇烈震蕩等2.變性因素當(dāng)前16頁，總共36頁。旋光值改變特性粘度增加溶解度降低擴(kuò)散系數(shù)降低結(jié)晶能力喪失易于沉淀，若加熱還會凝固。但若遠(yuǎn)離等電點(diǎn)則不一定沉淀變性后蛋白質(zhì)肽鍵暴露而更加易于消化3.變性后蛋白質(zhì)的表現(xiàn)當(dāng)前17頁，總共36頁。變性蛋白質(zhì)為什么能復(fù)性？

在一定的環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)能夠決定二、三、四級結(jié)構(gòu)。變性蛋白質(zhì)的二、三、四級結(jié)構(gòu)雖然遭到破壞，但是一級結(jié)構(gòu)仍然保持不變，因此除去變性劑后，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，蛋白質(zhì)能卷曲折疊成為能量最低的構(gòu)象，一般天然蛋白質(zhì)正是具有這種能量最低的構(gòu)象。當(dāng)前18頁，總共36頁。五、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則根據(jù)分子量：如沉降速度法離心根據(jù)密度：沉降平衡法離心根據(jù)電荷和分子量：聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)分子量和分子形狀：凝膠過濾根據(jù)溶解度：硫酸銨分級沉淀、有機(jī)溶劑分級沉淀根據(jù)電荷：等電點(diǎn)沉淀當(dāng)前19頁，總共36頁。六、蛋白質(zhì)的分離純化方法

透析：利用半透膜的選擇通透性來純化象蛋白質(zhì)這樣的大分子物質(zhì)的過程叫透析。超過濾：是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)分子被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的，有時要用切向流過濾法。（一）根據(jù)分子大小不同的分離純化方法當(dāng)前20頁，總共36頁。凝膠過濾法

凝膠過濾（層析）是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。當(dāng)前21頁，總共36頁。當(dāng)前22頁，總共36頁。（二）利用溶解度差別的純化方法影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。溶解度歸根結(jié)底取決于他們本身的分子結(jié)構(gòu)。等電點(diǎn)沉淀技術(shù)：在等電點(diǎn)pH條件下，蛋白質(zhì)為電中性，其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶解度、黏度、滲透壓等都表現(xiàn)為最低值，易發(fā)生絮結(jié)沉淀。因此，等電點(diǎn)性質(zhì)常被用于蛋白質(zhì)的分離制備，被稱為等電點(diǎn)沉淀技術(shù)。當(dāng)前23頁，總共36頁。

鹽析：當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。有機(jī)溶劑分級分離法：引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。

溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：0-40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增加。當(dāng)前24頁，總共36頁。（三）根據(jù)電荷不同的純化方法

電泳：在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。原則上按電泳的原理來分，可分為：自由界面電區(qū)帶電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）三種物理效應(yīng)：樣品的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)。當(dāng)前25頁，總共36頁。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m當(dāng)前26頁，總共36頁。Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%當(dāng)前27頁，總共36頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis當(dāng)前28頁，總共36頁。當(dāng)前29頁，總共36頁。此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。離子交換：當(dāng)前30頁，總共36頁。當(dāng)前31頁，總共36頁。（六）親和層析

親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的?？乖涂贵w激素和受體蛋白凝集素和糖蛋白當(dāng)前32頁，總共36頁。配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體當(dāng)前33頁，總共36頁。七、蛋白質(zhì)的含量測定與純度測定蛋白質(zhì)的量是研究蛋白質(zhì)的最基本的一步。溶液中蛋白質(zhì)的濃度測定方法很多，最早的經(jīng)典方法是凱氏定氮法，稍后應(yīng)用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年來大多數(shù)人用考馬斯亮藍(lán)法。（一）蛋白質(zhì)的含量測