13-傅-HRM技術(shù)檢測CNV - 副本

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心精準醫(yī)療實驗診斷中心傅啟華HRM技術(shù)檢測CNVCNV基因組拷貝數(shù)變異Copynumbervariation基因組拷貝數(shù)變異與基因組參考序列相比，基因組中大于1kb的DNA片段插入、缺失和/或擴增，及其互相組合衍生出的復(fù)雜變異，部分變異引起的基因劑量改變可以導(dǎo)致表型改變。單基因病與罕見疾病復(fù)雜疾病拷貝數(shù)變異檢測方法拷貝數(shù)變異檢測方法CategoriesTechnicalplatformsKeyfeaturesCytogeneticmethods核型分析

基因組全部染色體異常的信息；檢測周期長，分辨率低；技術(shù)要求高，推廣受限FISH在染色體原位顯色、定位準確，所需標本少；可能會漏診，陽性率低；

操作復(fù)雜、價格昂貴PCR-basedmethodsRT-PCR快捷、簡便、成本低廉；

半定量，通量低

MLPA可同時對40余個位點進行檢測；半定量，應(yīng)用廣泛Microarray-basedmethods

ArrayCGH全基因組檢測，分辨率高，價格昂貴高分辨率熔解曲線高分辨率熔解曲線雙鏈核苷酸（dsDNA）的熱穩(wěn)定性受其長度和堿基組成的影響。利用僅可嵌入并結(jié)合dsDNA的熒光染料，通過實時檢測其熔解過程中熒光信號值的變化，可以生成不同形狀熔解曲線的方式將PCR產(chǎn)物中存在的差異直觀地展示出來。限量dNTP競爭PCR結(jié)合HRM技術(shù)限量dNTP競爭PCR結(jié)合HRM技術(shù)在同一反應(yīng)管內(nèi)，靶基因和參考基因進行同步擴增，其中dNTP的量是限定的，由于競爭作用，當一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴增產(chǎn)物相對逐漸減少，而擴增產(chǎn)物的比值和它們初始狀態(tài)時模板的相對定量是一致的。限量dNTP競爭PCR結(jié)合HRM技術(shù)限量dNTP競爭PCR結(jié)合HRM技術(shù)引物設(shè)計：1.片段長度60-120bp2.引物及目的片段序列無SNP位點3.數(shù)對引物Tm值盡可能相近4.目的序列與內(nèi)參熔解峰相隔>4℃dsDNAMeltingPrediction:/umelt/umelt.htmlPredictionHRM技術(shù)檢測CNV案例22q11.2微缺失綜合征22q11.2微缺失綜合征Estimatedoccurrence新生兒中發(fā)生率約1/4000人類最常見的染色體微缺失綜合征臨床表型差異大、部分癥狀出現(xiàn)晚，患者的確診時間被推遲75%的22q11.2微缺失患者均存在先天性心臟病的癥狀MLPA22q11區(qū)域CNV檢測結(jié)果顯示22q11.2缺失EacharraycontainsseveralpairsofprobesthatcanbeligatedtoeachotherandsubsequentlyamplifiedbyPCRwithuniversalfluorescent-labeledprimerpairs.CNVplex?introducesthelengtheningligationsystemwhichensuresallthesizeofprobestobewithin170bpandcommerciallyavailableinsteadofcloningwhichallowscheapandrapidprobepreparation.Discriminationofprobesoligonucleotideswasquadrupleusingfouruniversalprimersetseachlabelledwithadifferentfluorophore,allowingupto192probestobeusedinasinglereaction.CNVplex?

BMCGenomics.2015,16:364.22q11.2微缺失綜合征Typicaldeletion（3Mb）Proximallynesteddeletion（1.5Mb）AtypicaldeletionCases3432Frequency87%8%5%ZhangX,etal.BMCGenomics.2015,16:36422q11.2微缺失綜合征22q11.2微缺失綜合征LCR-A—LCR-B:CLTCL1LCR-B—LCR-C:KLHL22LCR-C—LCR-D:P14KASNAP29上下游引物0.125μM-1μMMgCl2

2mMKlenTaq酶0.4UdNTP6.25μMDNA50-100ngLCGreen?Plus染料1X10ul體系診斷缺失的同時，判斷缺失長度范圍22q11.2微缺失綜合征22q11.2微缺失綜合征22q11.2區(qū)域基因拷貝數(shù)檢測結(jié)果A、B、C分別為CFTR參考序列熔解峰及CLTCL1、SNAP29、PI4KA和KLHL22檢測序列熔解峰。其中黑色為正常對照樣本（拷貝數(shù)=2），紅色為拷貝數(shù)缺失樣本（拷貝數(shù)=1），C中綠色為PI4KA基因拷貝數(shù)正常，KLHL22基因拷貝數(shù)缺失樣本。?dF／dT：熒光相對于溫度的一階負導(dǎo)數(shù)。SMA脊肌萎縮癥(Spinalmuscularatrophy,SMA)由于脊髓前角運動神經(jīng)元退化引起的神經(jīng)肌肉性疾病，為發(fā)病率僅次于囊性纖維化的常染色體隱性遺傳疾病。運動神經(jīng)元存活基因(Survivalmotorneurongene,SMN)是SMA的主要致病基因，約95%的SMA患者存在SMN1基因純合缺失。SMASMA對SMN1基因外顯子7和8的缺失檢測是SMA基因診斷的一種簡便、特異的方法，同時作為一種無創(chuàng)性檢查，該方法易被患兒接受。SMN1雜合缺失攜帶者頻率高達1/40–1/50。通過對雜合缺失攜帶者的篩查來降低潛在的傳遞致病基因和生育SMA患兒的風(fēng)險是降低SMA發(fā)病率的最有效途徑。SMASMAMLPA是當前較常用的SMN1基因拷貝數(shù)分析方法，但其操作步驟繁復(fù)、檢測時間長、對技術(shù)人員操作及分析能力要求較高，同時MLPA檢測試劑及分析耗材昂貴，較高的成本給其在SMA疾病分子診斷及人群篩查中的應(yīng)用帶來諸多挑戰(zhàn)。限量dNTP競爭PCR結(jié)合HRM技術(shù)操作步驟少、準確度高，尤其是在高檢測通量及低投入價格等方面的優(yōu)勢使其比MLPA更適合于攜帶者的篩查。上下游引物0.25μM-0.5μMMgCl2

2mMKlenTaq酶0.4UdNTP6.25μMDNA50-100ngLCGreen?Plus染料1X10ul體系SMN1-E7/CFTR檢測體系SMN1-E7+E8/TPGS2檢測體系MLPASMA的分子診斷TheSMN2copynumberisveryvariablewithonly60-70%ofindividualshavingtwocopiesParentsControlsPatients中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（2）：136-140SMASMN1基因拷貝數(shù)檢測結(jié)果A、B分別為SMN1-E7拷貝數(shù)檢測體系及SMN1-E7+E8共同檢測體系結(jié)果圖。其中紅色為正常對照樣本（拷貝數(shù)=2），藍色為目標基因一個拷貝缺失樣本（拷貝數(shù)=1），黑色為目標基因完全缺失標本（拷貝數(shù)=0）。?dF／dT：熒光相對于溫度的一階負導(dǎo)數(shù)。HRMforCNV操作簡便快捷，僅包括PCR及