P與肝癌的基因治療

P與肝癌的基因治療第1頁/共20頁2023/3/172肝癌機(jī)制抑癌基因p53p53基因與肝癌的基因治療存在的問題展望第2頁/共20頁2023/3/173

肝癌概念：指肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞較常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌本病以40～49歲為多，男女發(fā)病率之比為2～5∶1每年新增病例：50多萬主要臨床表現(xiàn)：肝區(qū)疼痛、肝臟腫大、黃疸、肝硬化癥狀等治療：手術(shù)、介入、放療、化療、生物和免疫治療等5年病死率：超過95%發(fā)生的癌腫第3頁/共20頁2023/3/174機(jī)制

腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，由于各種基因表達(dá)及其調(diào)控的變化，使細(xì)胞在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)上表現(xiàn)出與正常細(xì)胞的顯著差異。正常細(xì)胞的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)為過度活躍，而另一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則被阻斷。這種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常干擾了細(xì)胞對(duì)增殖、分化、凋亡等多方面的自身調(diào)控，特別是造成細(xì)胞增殖和凋亡失控，成為腫瘤發(fā)病的重要分子基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因治療技術(shù)在腫瘤的治療中具有廣闊的前景?；蛑委煹姆绞接袃深悾活悶榛虺C正與置換，即將缺陷基因的異常序列進(jìn)行校正，對(duì)缺陷基因進(jìn)行精確的原位修復(fù)；另一類為基因增補(bǔ)，不去除異常基因，而是通過外源基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)正常產(chǎn)物，從而補(bǔ)償缺陷基因的功能，達(dá)到治療目的的一種方法。第4頁/共20頁2023/3/175抑癌基因

抑癌基因的突變、缺失及失活在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。目前，新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因?qū)映霾桓F，較常見的有p53、p16、Rb、BCL-XS等。隨著人們對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的深人了解，越來越多的證據(jù)表明：p53基因的突變與失活和肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。近年來，隨著手術(shù)、放療及生物治療等方法的研究進(jìn)展，使腫瘤綜合治療水平有了明顯提高，尤其是腫瘤體外細(xì)胞和動(dòng)物模型基因治療，逐漸從單純的基礎(chǔ)研究過渡到臨床研究和應(yīng)用。本文主要從p53在肝癌基因治療方面作一簡要介紹。

第5頁/共20頁2023/3/176p53生物體所有組織都存在p53蛋白，在整個(gè)進(jìn)化中變現(xiàn)高度保守。雖然p53對(duì)生命不是必需的，但是在細(xì)胞水平維持遺傳穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用。這是極端重要的，因?yàn)檫z傳損傷逐漸導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生癌。六分之一人群由于p53功能缺陷發(fā)展成癌這一統(tǒng)計(jì)判斷，強(qiáng)調(diào)指出p53作為一種腫瘤抑制蛋白的重要性。在對(duì)DNA損傷應(yīng)答時(shí)激活p53蛋白，以轉(zhuǎn)錄因子而起作用，能結(jié)合DNA特異序列（p53應(yīng)答元件），而且上調(diào)靶基因的表達(dá)。在這些條件下，p53誘導(dǎo)細(xì)胞生長停止或者程序性細(xì)胞死亡（凋亡）。這兩種應(yīng)答預(yù)防細(xì)胞群內(nèi)遺傳損傷的復(fù)制和擴(kuò)增。第6頁/共20頁2023/3/177DNAdamagep53CellgrowtharrestApoptosisp53activationandaccumulation第7頁/共20頁2023/3/178

細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的濃度增加是其對(duì)DNA損傷的應(yīng)答。這種作用不依賴于基因轉(zhuǎn)錄而涉及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制，與預(yù)先存在p53mRNA增加的翻譯有關(guān)。在整個(gè)基因表達(dá)調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄后的機(jī)制是重要的，而且特別是可能比轉(zhuǎn)錄調(diào)控有更快的應(yīng)答。該過程涉及胞漿內(nèi)mRNA-蛋白質(zhì)的相互作用，但是p53濃度增加的精確機(jī)制是不清楚的。第8頁/共20頁2023/3/179p53基因與肝癌的基因治療

p53基因應(yīng)用于肝癌的基因治療,是以正常的野生型p53基因替代肝癌細(xì)胞中突變的p53基因。利用基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，尋找高效、導(dǎo)向性的載體系統(tǒng)成為肝癌基因治療臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。目前,向肝癌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)人外源基因的方法主要有病毒法和非病毒法兩種。第9頁/共20頁2023/3/1710病毒法常用的病毒以逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒作載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只感染處于分裂期的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞，而對(duì)高分化不分裂的細(xì)胞就不能實(shí)施基因轉(zhuǎn)移。腺病毒載體則對(duì)各期的細(xì)胞均可感染，所以目前腺病毒載體更常用作p53轉(zhuǎn)移的載體，腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療已廣泛開展。第10頁/共20頁2023/3/1711

Rei-setM等通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)：腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可有效地將p53基因?qū)四[瘤細(xì)胞中；以GFP為報(bào)告基因，觀察到了腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞BEL402、HLE及HuH

7均有很高的轉(zhuǎn)染率，腺病毒能有效地將目的基因?qū)敫伟┘?xì)胞中并高效表達(dá)。BIY2102腺病毒載體轉(zhuǎn)染后能顯著提高p53突變的HIE和HUH27細(xì)胞對(duì)順鉑和絲列霉素2C的敏感性，增強(qiáng)了化療藥物對(duì)HIE和HUH27細(xì)胞的殺傷作用，這為以腺病毒為載體將目的基因?qū)烁伟┘?xì)胞提供了前提。有資料顯示：用野生型p53腺病毒載體經(jīng)肝動(dòng)脈注射治療轉(zhuǎn)移性肝癌的臨床試驗(yàn)，野生型p53基因?qū)烁伟┘?xì)胞中，可以發(fā)揮殺滅或抑制肝癌細(xì)胞生長的作用

，Terence等以受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)介導(dǎo)野生型p53轉(zhuǎn)染含突變p53的肝癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)能明顯抑制瘤細(xì)胞的生長，通過表達(dá)wtp53重組腺病毒載體，將p53基因?qū)烁伟┘?xì)胞株一PLE/PRE/5細(xì)胞，通過誘導(dǎo)其凋亡和細(xì)胞周期阻滯可抑制癌細(xì)胞的生長。第11頁/共20頁2023/3/1712舉例方法：構(gòu)建含人p53、B7-1、GM-CSF和IL-24種目的基因的重組腺病毒載體，感染3種肝細(xì)胞癌細(xì)胞系和肝細(xì)胞系L02，運(yùn)用ELISA、免疫組化、流式細(xì)胞儀等方法，檢測(cè)目的基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，和對(duì)肝癌細(xì)胞生長的抑制及誘導(dǎo)其凋亡的作用。結(jié)果：肝癌細(xì)胞對(duì)腺病毒高度易感，腺病毒多重感劑量為50(50MOI)時(shí)，可使90%左右的肝細(xì)胞癌表達(dá)目的基因。除IL-2外，其他3個(gè)目的基因都能在肝癌細(xì)胞中高效表達(dá)。導(dǎo)入多基因后，肝癌細(xì)胞的生長受到一定程度的抑制，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；而L02肝細(xì)胞的生長卻未受影響。結(jié)論：腺病毒載體是進(jìn)行肝癌基因治療的理想載體，由一個(gè)腺病毒載體介導(dǎo)的多種目的基因，能在肝癌細(xì)胞系中高效表達(dá)，且能抑制肝癌細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)其調(diào)亡。

---------《腺病毒介導(dǎo)多基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生長的影響》

中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志2000年第6期第7卷

第12頁/共20頁2023/3/1713非病毒法脂質(zhì)體載體脂質(zhì)體(liposome)是磷脂依靠疏水締合作用在水中自發(fā)形成的一種分子有序組合體，為多層囊泡結(jié)構(gòu)，每層均為類脂雙分子膜，層間和脂質(zhì)體內(nèi)核為水相，雙分子膜為油相。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移具有以下優(yōu)勢(shì)：①脂質(zhì)體是非病毒性載體，轉(zhuǎn)染過程方便易行，重現(xiàn)性好，與細(xì)胞膜融合將目的基因?qū)爰?xì)胞后，脂質(zhì)即被降解，無毒，無免疫原性；②DNA或RNA可得到保護(hù)，不被滅活或被核酸酶降解；③脂質(zhì)體攜帶的基因可能轉(zhuǎn)運(yùn)至特定部位；④體外和體內(nèi)試驗(yàn)都表明，接近染色體大小的DNA片段也能被轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主基因組中并增長。運(yùn)用脂質(zhì)體作為載體較單純導(dǎo)人基因具有更高的轉(zhuǎn)染效率，在一定范圍內(nèi)，基因的量與轉(zhuǎn)染效率成正比，同時(shí)宿主體不會(huì)出現(xiàn)外源性病毒基因所致的特異性免疫反應(yīng)，表達(dá)時(shí)間較腺病毒載體長、分裂期及非分裂期細(xì)胞均可被轉(zhuǎn)染等特點(diǎn)。研究表明轉(zhuǎn)鐵蛋白能增強(qiáng)脂質(zhì)體一基因轉(zhuǎn)染。第13頁/共20頁2023/3/1714舉例方法：將載有人野生型p53-cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒p53-pcDNA3，用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)p53-pcDNA3對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響。結(jié)果：通過觀察細(xì)胞生長曲線與流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞的凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞生長受到明顯的抑制。結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo)的p53基因可在HepG2細(xì)胞中表達(dá)，且明顯抑制該細(xì)胞的生長。

---------《脂質(zhì)體介導(dǎo)的p53基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生長的抑制作用》免疫學(xué)雜志2000年第5期第16卷第14頁/共20頁2023/3/1715PTD融合蛋白系統(tǒng)PTD融合蛋白系統(tǒng)(proteintransduetion

domain，PTD)是一個(gè)富含堿性氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域，PTD融合蛋白系統(tǒng)被認(rèn)為是一種很有前途的運(yùn)載工具。丁忠陽等成功構(gòu)建了含p53基因的原核表達(dá)載體pTATHA／p53，在大腸桿菌BI21(DE3)Lyss內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行了純化。通過純化的p53蛋白經(jīng)腹腔免疫BALB／c小鼠，制備高效價(jià)的抗血清，為應(yīng)用PTD—p53基因治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究奠定了理論基礎(chǔ)。第15頁/共20頁2023/3/1716舉例方法:利用RT-PCR方法從A549細(xì)胞系中分離野生型p53基因,將該基因分別克隆入pTATHA和pET32a原核表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)LysS內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行純化。以純化的p53蛋白經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠,制備高效價(jià)的抗血清。將PTD-p53融合蛋白加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用間接免疫熒光法檢測(cè)PTD-p53融合蛋白導(dǎo)入HepG2細(xì)胞的效率。結(jié)果:成功地構(gòu)建了含有野生型p53基因的原核表達(dá)載體,表達(dá)純化了p53融合蛋白及p53蛋白,證實(shí)PTD-p53可以高效地轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞。結(jié)論：PTD-p53融合蛋白的表達(dá)純化及活性分析,為應(yīng)用PTD-p53蛋白治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究奠定了理論基礎(chǔ)。--------《PTD-p53融合蛋白的表達(dá)、純化及其對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性》期刊榮譽(yù)：ASPT來源刊

CJFD收錄刊第16頁/共20頁2023/3/1717

存在的問題

p53基因在治療人類惡性腫瘤基因治療中取得了一定的成績，但仍存在許多不足之處。①缺乏高效的載體系統(tǒng)，目前被應(yīng)用的載體都存在自身局限性，而且病毒本身也可導(dǎo)致相應(yīng)的不良反應(yīng)。②p53基因目的基因的持續(xù)表達(dá)。③降低p53基因在宿主體內(nèi)的毒性和免疫原性是否會(huì)誘發(fā)原癌基因以及病人的安全性(如最小治療劑量、最大毒性、耐受性及誘變性)等問題都有待進(jìn)一步解決。第17頁/共20頁2023/3/1718展望p53基因是一種理想的分子靶向肝癌治療基因之一。通過人工轉(zhuǎn)導(dǎo)修補(bǔ)突變的p53基因，可恢復(fù)其抑癌功能，通過拯救突變型p53